关于“通过化学交联结合毛细管电泳与纳米孔测序技术绘制小分子-RNA结合位点”研究的学术报告
本报告旨在向中文科研界详细介绍一项发表于《Nucleic Acids Research》期刊的原创性研究。该研究由 Xueyi Yang, Jielei Wang, Noah A. Springer, Patrick R.A. Zanon, Yilin Jia, Xiaoxuan Su 以及通讯作者 Matthew D. Disney 所领导的团队（主要来自美国 The Herbert Wertheim UF Scripps Institute for Biomedical Innovation & Technology 和 The Scripps Research Institute）完成，并于2025年在线发表（DOI: 10.1093/nar/gkaf231）。研究聚焦于化学生物学与核酸化学领域，核心目标是开发并优化一套系统性的实验平台，用于精确鉴定能与RNA共价结合的小分子化合物（化学探针）在靶标RNA上的具体结合位点，以推动靶向RNA的生物活性小分子的开发。
一、 学术背景与研究目标
靶向RNA的小分子作为一种有别于寡核苷酸药物的新兴治疗策略，近年来受到广泛关注。然而，其开发面临两大核心挑战：一是确证小分子确实与预期的RNA靶标结合（靶标验证），二是精确识别其结合位置（结合位点鉴定）。这两个环节对于理解小分子作用机制、指导后续的化学结构优化以及评估潜在的脱靶效应至关重要。
为此，研究团队先前发展了一种称为“化学交联与下拉分离”（Chem-CLIP）的策略。其基本原理是将一个能与特定RNA结合的小分子配体，与一个化学反应模块（如交联基团）和一个纯化标签（如生物素）连接起来，形成一个化学探针。该探针与RNA结合后，通过化学反应形成共价键，再利用纯化标签将交联的RNA复合物富集出来，进而分析结合位点。传统的位点分析方法主要依赖于共价交联阻碍逆转录酶延伸而产生的“逆转录终止位点”（RT stops），并通过测序确定终止位置。
尽管Chem-CLIP策略有效，但在实际操作中，如何快速、经济、高精度地鉴定结合位点，尤其对于不同反应活性探针的普适性流程，仍有待完善。本研究的目标正是系统性地优化和整合多种方法，建立一个从初步验证到高精度定位的完整工作流程。研究采用一个已验证的结合对——小分子HAP与其高亲和力RNA适配体Aptamer 21——作为模型系统，对不同的交联化学模块进行评估，并建立了基于毛细管电泳的快速RT stops分析方法和基于纳米孔测序的单核苷酸分辨率突变谱分析（Mutational Profiling）方法。
二、 详细工作流程
研究流程严谨而系统，主要包含以下几个关键阶段：
1. 化学探针的设计与合成 研究首先设计并合成了两类基于HAP配体的化学探针。第一类探针（如2a, 2b, 2c）在HAP上连接了N-氯乙基苯胺（即氯氨布丁类似物）作为交联模块。这类化合物能在生理条件下原位形成高反应活性的氮丙啶离子，与RNA碱基发生烷基化反应形成共价键。第二类探针（如3）则连接了光反应性双吖丙啶（Diazirine）模块，其在紫外光照射下会产生活性卡宾中间体，与邻近分子形成共价交联。所有探针还携带一个炔基手柄，用于后续通过铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC, “点击化学”）连接报告分子（如荧光染料TAMRA）或纯化标签（如生物素-叠氮化物）。作为对照，研究也合成了不含HAP配体、仅含交联模块和炔基的对照探针（4a, 4b, 5），用以评估非特异性交联背景。
2. 荧光标记法评估靶标结合与交联效率 为快速评估和比较不同探针的交联反应活性和特异性，研究团队建立了一种基于荧光的标记实验。流程如下：将折叠好的Aptamer 21 RNA与不同浓度的探针共孵育（对于双吖丙啶探针需进行UV照射），使交联反应发生。随后，通过点击化学将交联复合物上的炔基与叠氮-TAMRA染料连接，使被标记的RNA带上荧光。最后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并分别通过TAMRA荧光通道和SYBR Gold RNA染色通道成像。通过比较HAP探针与对照探针的TAMRA信号强度比，可以直观地量化由特异性结合驱动的交联效率。此方法简便快捷，可用于初步筛选高活性、高特异性的探针。
3. 基于毛细管电泳的RT Stops分析快速定位结合位点 共价交联的RNA在逆转录过程中，逆转录酶会在交联位点被阻碍，产生截短的cDNA。研究开发了一种利用自动化毛细管电泳平台快速分析这些RT stops的方法。具体步骤：将经探针处理的RNA使用SuperScript III逆转录酶进行逆转录，该酶对位点阻碍敏感。随后，无需PCR扩增，直接将cDNA产物在Fragment Analyzer系统上进行毛细管电泳分离。为了精确定位，研究定制了一套与目标cDNA序列完全一致的DNA寡核苷酸梯状标记物（Ladder）。通过将样品cDNA片段的大小与定制Ladder比对，可以推断出交联发生的核苷酸位置，误差范围在±1个核苷酸左右。这种方法具有高通量（96孔板格式）、所需样品量少（仅需ng级cDNA）和定量化的优点，能够快速估算结合位点。
4. 逆转录酶筛选与富集流程建立，为突变谱分析做准备 为了达到单核苷酸分辨率，研究转向突变谱分析策略。其原理是：某些逆转录酶在读取到被修饰的核苷酸时，并非总是终止，有时会“通读”但在该位置引入错配、缺失或插入等突变。通过对交联RNA进行逆转录、PCR扩增、测序并统计每个位置的突变率，即可精确定位交联热点。 研究首先筛选了多种已知用于突变谱分析的逆转录酶，包括Induro RT, TGIRT III, MarathonRT, SuperScript II 和 SuperScript IV。使用高活性的氯氨布丁探针2a处理RNA后，分别用这些酶在相应条件下进行逆转录，并通过毛细管电泳评估其“通读”能力（即观察截短cDNA减少、全长cDNA增加的比例）。结果发现，SuperScript II, Induro RT 和 MarathonRT 能有效通读交联位点，其中SuperScript II的通读效率最高且最稳定。 同时，针对低活性探针（如双吖丙啶探针3），为了增强突变信号，研究优化了富集流程：交联后，通过点击化学将探针上的炔基与二硫键-生物素-叠氮化物连接，然后使用链霉亲和素磁珠进行下拉富集。最后，用还原剂TCEP断裂二硫键，将交联的RNA从磁珠上洗脱下来，用于后续分析。这一步骤能显著提高信噪比，使得对低丰度交联事件的分析成为可能。
5. 基于纳米孔测序的突变谱分析实现单核苷酸分辨率定位 这是本研究的核心创新方法之一。工作流程如下：将经过（或未经过）富集的、探针交联的RNA样本，使用筛选出的最佳逆转录酶（SuperScript II）在利于引入突变的缓冲条件下进行逆转录。随后，使用与RT引物配对的引物对cDNA进行PCR扩增，构建测序文库。研究采用牛津纳米孔技术进行测序。测序完成后，通过生物信息学流程将 reads 比对到参考序列（Aptamer 21），并使用自定制的代码从比对结果中提取每个核苷酸位置的覆盖率以及替换、缺失、插入等突变信息，计算突变率。为了凸显探针诱导的特异性突变，通常会将对照探针处理样本的突变率从实验探针处理样本的突变率中扣除，得到“相对突变率”图谱。突变率显著升高的峰即指示可能的交联位点。
6. 其他辅助分析与验证 * 质谱验证：将探针2a交联的RNA完全酶解为核苷，通过液相色谱-质谱联用技术检测，确认了腺苷和胞苷加合物的形成，从化学层面验证了交联事件。 * 直接RNA纳米孔测序探索：研究还初步尝试了使用纳米孔平台对交联RNA进行直接测序（不经过逆转录），发现大体积加合物会导致 reads 在交联位点附近提前终止，这也为结合位点分析提供了一种潜在的补充思路。
三、 主要研究结果
1. 探针反应活性与特异性比较： 荧光标记实验明确显示，基于N-氯乙基苯胺的探针（2a, 2b）比基于双吖丙啶的探针（3）具有显著更高的反应活性和特异性。在最佳浓度下，2a的HAP/对照信号比可达14倍，而3仅为4倍。竞争实验和与非结合突变体RNA（21-R）的反应进一步证明，HAP配体的存在是探针与Aptamer 21发生高效、特异性交联的关键。质谱分析证实了2a主要与腺苷和胞苷形成加合物。
2. 毛细管电泳RT Stops分析结果： 对于探针2a，在不富集的情况下，毛细管电泳清晰检测到两个主要的RT终止位点，分别对应于Aptamer 21上的A19和A34位点，截短cDNA占比总计约52%。对于探针3，仅在UV照射后检测到两个较弱的、UV依赖性的RT终止位点，对应于C20和U38位点，占比仅约6%。富集步骤极大地纯化了交联RNA，使3的信号得以凸显，且终止位点与未富集样本一致。
3. 突变谱纳米孔测序结果： 这是实现高精度定位的关键。对于探针2a，即使不经富集，突变谱分析也成功识别出两个主要的突变热点区域（C16-C20和G29-A34），其中C20和A34的突变率最高，与RT Stops分析结果（A19和A34）高度吻合，误差在±1个核苷酸内。经过富集后，C20和A34的突变率大幅提升至45%和16%，信号显著增强。 对于探针3，不经富集时未检测到显著突变信号。经过富集后，突变谱清晰地揭示出三个主要位点：A18、U40和G58。这与RT Stops分析得到的C20和U38位点部分重叠（C20/A18, U38/U40），但也发现了新的位点（G58）。两种方法结果的总体一致性相互印证了其可靠性，差异可能源于不同分析方法对同一交联事件的不同“解读”（终止 vs. 通读突变），以及探针连接臂柔性导致的微区结合模式差异。 此外，分析还发现不同探针诱导的突变类型不同：2a主要在交联位点诱导碱基替换，而3则更倾向于诱导缺失。这反映了不同交联化学和加合物结构对逆转录酶催化过程的影响存在差异。
4. 逆转录酶筛选结果： 在通读大体积小分子-RNA加合物方面，SuperScript II表现最优，其通读效率不受后续点击化学和生物素标签引入所带来的体积增大的显著影响，始终保持约75-80%的全长cDNA产率，因此被选定为突变谱分析的专用酶。
四、 研究结论与意义
本研究成功建立并优化了一个整合多种技术的综合性平台（Chem-CLIP-MAP-Seq），用于系统性地绘制小分子-RNA共价结合位点。该平台包含三个层次的方法：1）荧光标记法用于快速评估探针反应活性与特异性；2）毛细管电泳RT Stops分析法用于快速、低成本地初步定位结合位点（~±1 nt精度）；3）纳米孔测序突变谱分析法用于实现单核苷酸分辨率的高精度定位，尤其适用于长RNA靶标。
研究的核心结论指出，在本模型系统中，N-氯乙基苯胺作为交联模块，在反应活性、特异性以及后续分析方法的便捷性上，均优于传统光亲和标记常用的双吖丙啶模块。同时，研究明确了SuperScript II逆转录酶在通读大体积共价加合物方面的优势，并证实了亲和富集步骤对于分析低反应活性探针的必要性。
这项工作的科学价值在于：1）为化学生物学领域提供了一套标准化、可推广的实验流程和数据解读框架，用于研究RNA-小分子相互作用。2）通过头对头比较，深化了对不同共价化学反应模块在RNA靶向探针中应用特性的理解，为未来探针设计提供了关键依据。3）展示了纳米孔测序技术在化学生物学应用中的潜力，其长读长、低成本、直接测序能力为分析复杂RNA修饰和加合物开辟了新途径。
其应用价值则直接服务于靶向RNA的药物发现：该平台可用于高通量筛选能与特定RNA结构域共价结合的小分子苗头化合物；可用于作用机制研究，精确定位先导化合物在靶RNA上的结合位点，指导结构优化；可用于脱靶效应评估，在转录组层面鉴定小分子的其他RNA结合靶标。
五、 研究亮点
该项研究不仅报道了一套强大的实验工具集，更通过严谨的比较和验证，为领域内研究人员选择探针化学、优化实验流程、解读复杂数据提供了宝贵的路线图和决策依据，是一项兼具方法论创新和实用指导意义的重要工作。