本研究由浙江大学药学院的唐铭敏、练栩源、张治真、郑国湾、张燕华，浙江大学海洋学院（舟山校区）的张治真，浙江省医疗器械审评中心的谢鑫，以及浙江省肿瘤医院药剂科的辛文秀共同完成。本研究于2020年10月12日被接受，发表于植物医学领域期刊 *Phytomedicine*。论文标题为《咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯的抗白血病效应及其作用机制证据》（Antileukemic effect of caffeic acid 3,4-dihydroxyphenetyl ester. Evidences for its mechanisms of action）。

本研究属于生物医学与药学交叉领域，聚焦于天然产物抗肿瘤活性的机制探索。研究背景始于中药肿节风（*Sarcandra glabra*）的临床应用，其注射液被用于治疗包括白血病在内的多种癌症，但其具体的抗癌成分和作用机制尚不明确。咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯（Caffeic acid 3,4-dihydroxyphenethyl ester, CADPE）是从肿节风水提物中分离得到的一种微量天然多酚酯。前期研究表明，CADPE对多种实体瘤具有显著活性，其作用涉及阻断STAT3介导的VEGF表达、抑制Fak/MEK/ERK介导的AP-1活化等多个靶点或信号通路。然而，CADPE是否对白血病细胞有效及其潜在的作用机制，在此研究之前完全未知。因此，本研究的首要目标是探究CADPE能否以及如何杀死白血病细胞。研究目的明确，旨在填补CADPE抗白血病活性研究的空白，并深入揭示其分子机制，为基于天然产物的新型白血病治疗策略开发提供科学依据。

本研究的实验流程设计严谨，环环相扣，主要包含以下五个关键步骤：

第一步：细胞活性筛选与安全性评估。 此步骤旨在评估CADPE对不同类型白血病细胞的广谱抑制活性，并考察其对正常细胞的毒性，以确定其选择性。研究使用了五种人源白血病细胞系作为研究对象，包括CCRF-CEM、Jurkat、Molt-4、K-562和HL-60细胞，并以外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMC）和人骨髓基质细胞（Human bone marrow stromal cells, HBMSC）作为正常对照。细胞样本量在MTT实验中表现为每孔1x10^4（部分细胞为5x10^3）细胞，所有实验均设置重复以保证统计效力。采用的标准实验方法是MTT法，这是一种通过检测线粒体活性来反映细胞存活和增殖的经典方法。具体流程为：细胞接种于96孔板稳定后，用不同浓度的CADPE以及阳性对照药物伊马替尼（Imatinib）和三氧化二砷（As2O3）处理72小时，随后加入MTT孵育，溶解甲臜产物后测量吸光度，计算细胞存活率。最后，使用GraphPad Prism 7.0软件计算半数抑制浓度（IC50）和对正常细胞的半数细胞毒性浓度（CC50）及选择性指数（SI）。数据处理采用了学生t检验和方差分析（ANOVA）后进行Tukey事后检验。此步骤本身并未涉及特殊发明的实验方法，但为后续机制研究奠定了关键的活性数据基础。

第二步：细胞周期与细胞凋亡表型确认。 在确定CADPE具有抗白血病活性的基础上，此步骤旨在探究其导致细胞死亡的具体表型是细胞周期阻滞还是细胞凋亡，或是两者兼有。研究对象主要为CCRF-CEM、Jurkat等白血病细胞系。采用流式细胞术进行定量分析。对于细胞周期分析，细胞经CADPE或伊马替尼处理24小时后，用冷乙醇固定，RNase A消化RNA，碘化丙啶（Propidium iodide, PI）染色DNA，然后上机检测，使用FlowJo软件分析细胞周期各时相（G0/G1、S、G2/M）及亚G1期（凋亡细胞）的分布。对于细胞凋亡检测，采用更灵敏的Annexin V-FITC/PI双染法。细胞处理48小时后，用Annexin V和PI共同染色，流式细胞仪检测，区分早期凋亡（Annexin V阳性/PI阴性）、晚期凋亡/坏死（Annexin V和PI双阳性）的细胞比例，同样使用FlowJo软件进行量化。

第三步：分子靶点与信号通路的初步探索。 基于表型结果，此步骤开始深入分子层面，探究CADPE作用的潜在靶点。主要研究对象为CCRF-CEM和Jurkat细胞。采用的核心实验技术是蛋白质印迹法（Western blot）。具体流程包括：收集经药物处理后的细胞，使用RIPA缓冲液裂解提取总蛋白；通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白；将蛋白转印至PVDF膜；用针对特定蛋白的一抗孵育，再用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育；最后使用化学发光（ECL）系统显影检测目标蛋白的表达水平。在此步骤中，研究者检测了一系列与细胞周期调控（如CDK2、CDK4、Cyclin D3、Cyclin A）和细胞凋亡（如Bcl-xL、Mcl-1、Survivin、PARP切割）相关的关键蛋白。此外，研究者特别关注了癌基因c-Myc，因为它在调控细胞周期和凋亡中处于核心地位。通过Western blot检测了CADPE对c-Myc蛋白水平的影响，并分析了其IC50值与细胞基础c-Myc水平的相关性。为了验证c-Myc作为靶点的有效性，还使用了两种已知的c-Myc特异性抑制剂10058-F4和JQ-1进行平行实验，比较其对细胞活性和相关蛋白的影响。

第四步：c-Myc蛋白稳定性调控机制的深入探究。 在证实CADPE能下调c-Myc后，此步骤进一步探究其下调c-Myc的具体机制，即是通过影响转录还是促进蛋白降解。主要研究对象为Jurkat等细胞。采用了时间效应关系实验和环己酰亚胺（CHX）追踪实验。首先，用CADPE处理细胞不同时间（短至1小时），通过Western blot观察c-Myc蛋白水平的动态变化，同时检测其mRNA水平（文中提到无变化）。接着，在蛋白质合成抑制剂CHX存在下，观察c-Myc蛋白的半衰期变化，并加入蛋白酶体抑制剂MG-132，以验证降解途径是否依赖于蛋白酶体。一个关键的创新性实验方法是共免疫沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）。为了直接证明CADPE促进了c-Myc的泛素化，研究者先用MG-132处理细胞以抑制蛋白酶体、积累泛素化蛋白，再加入CADPE。然后，用c-Myc抗体从细胞裂解液中“拉下”c-Myc蛋白及其结合物，再通过Western blot检测其上是否结合有泛素（Ubiquitin）。这个实验提供了CADPE促进c-Myc泛素化的直接证据。

第五步：上游调控通路的阐明。 这是机制研究的最后一步，旨在回答CADPE如何启动c-Myc的泛素-蛋白酶体降解通路。研究对象为Jurkat细胞。主要方法仍为Western blot，但关注点转向了调控c-Myc稳定性的上游关键因子。研究者系统地检测了：1）去泛素化酶USP28，它负责移除c-Myc上的泛素标签以稳定c-Myc；2）糖原合酶激酶3β（Glycogen synthase kinase-3β, GSK3β）及其磷酸化形式（p-GSK3β Ser9），因为GSK3β的活化能磷酸化c-Myc；3）c-Myc蛋白本身的磷酸化位点Thr58（p-c-Myc T58）和Ser62（p-c-Myc S62），这两个位点的磷酸化状态决定了其被E3泛素连接酶FBW7识别的效率；4）FBW7的其他已知底物蛋白（如Notch1、Cyclin E、Mcl-1）的水平变化，以间接反映FBW7的活性。通过检测CADPE处理后这些蛋白在极早期（如5分钟）的动态变化，研究者勾勒出了完整的调控链条。

本研究取得了一系列相互印证、逻辑严谨的重要结果，逐步揭示了CADPE的抗白血病机制。

在第一步中，MTT实验结果显示，CADPE对所有测试的五种白血病细胞系均表现出显著的生长抑制活性，IC50值在3.53 μM (Jurkat) 到13.8 μM (HL-60) 之间。相比之下，它对正常PBMC的毒性很低（CC50 > 200 μM），选择性指数（SI）高达14.5至56.7以上，远高于阳性药伊马替尼（除K-562外）和三氧化二砷。对HBMSC的实验进一步证实，即使高达100 μM的CADPE也不影响其活力和形态。这些数据清晰地证明，CADPE具有强效且高选择性的抗白血病活性，为其作为潜在治疗候选物提供了首要证据。这一结果直接推动了后续研究，因为我们需要解释这种选择性和有效性的分子基础。

第二步的表型结果提供了直接解释。流式细胞术显示，CADPE处理能诱导白血病细胞发生亚G1期累积（凋亡标志）并将细胞周期阻滞在G0/G1期。同时，Annexin V/PI双染证实CADPE能显著诱导细胞凋亡（在CCRF-CEM、Jurkat等细胞中），而伊马替尼的促凋亡效果较弱。这表明CADPE的抗增殖效应是通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡共同实现的。

第三步的分子机制探索将表型与具体蛋白变化联系起来。Western blot结果显示，CADPE能下调多种G0/G1期关键的细胞周期调节蛋白（CDK4、Cyclin D3、Cyclin A）和关键的抗凋亡蛋白（Bcl-xL、Mcl-1、Survivin）。更重要的是，研究发现所有测试的白血病细胞系都高表达c-Myc蛋白，而正常PBMC中几乎检测不到。CADPE处理后能快速下调c-Myc水平，并且其IC50值与细胞基础c-Myc水平呈负相关。这一发现至关重要：它意味着c-Myc高表达的白血病细胞对CADPE更敏感，而c-Myc低表达的正常细胞受影响小，这完美解释了第一步中观察到的高选择性。同时，c-Myc作为细胞周期和凋亡的核心调控因子，其下调可以逻辑上解释第二步中观察到的细胞周期阻滞和凋亡表型，以及第三步中观察到的下游靶蛋白（CDKs、Cyclins、Bcl-xL等）变化。使用c-Myc抑制剂10058-F4和JQ-1的实验进一步支持了c-Myc是有效靶点，但结果显示CADPE能更广泛地下调多个相关蛋白，提示其作用机制可能不同于已知的c-Myc直接抑制剂，可能涉及更上游的调控。

于是，研究进入第四步。时间效应实验显示，CADPE在1小时内就能快速降低c-Myc蛋白水平，但不影响其mRNA，提示作用发生在转录后水平。CHX追踪实验表明，CADPE能显著缩短c-Myc蛋白的半衰期，而蛋白酶体抑制剂MG-132可以逆转这一效应。最关键的直接证据来自Co-IP实验：在MG-132存在的条件下，CADPE处理能显著增加与c-Myc结合的泛素化蛋白水平。这些结果无可辩驳地证明，CADPE是通过促进c-Myc的泛素-蛋白酶体依赖性降解来发挥作用的。

最后，第五步的研究揭示了CADPE启动这一降解程序的上游信号。Western blot结果显示，CADPE在极短时间内（5分钟）就能下调去泛素化酶USP28的水平，这削弱了细胞稳定c-Myc的能力。同时，它降低了GSK3β的抑制性磷酸化（p-GSK3β Ser9），意味着激活了GSK3β。活化的GSK3β进而磷酸化c-Myc的Thr58位点（p-c-Myc T58稳定），同时伴随Ser62位点磷酸化（p-c-Myc S62）的下调。这种磷酸化模式的改变，正是c-Myc被E3泛素连接酶FBW7高效识别并启动泛素化降解的经典信号。此外，CADPE还能快速下调FBW7的其他底物（Notch1, Cyclin E, Mcl-1），进一步旁证了它增强了FBW7介导的降解通路活性。

本研究得出结论：从中药肿节风中分离的天然多酚酯CADPE，是一种新型的c-Myc抑制剂。它通过激活GSK3β和下调去泛素化酶USP28，触发c-Myc与E3泛素连接酶FBW7的相互作用，从而促进c-Myc的泛素-蛋白酶体依赖性降解。c-Myc的降解进而导致其下游的细胞周期调节蛋白（如CDK4、Cyclin D3、Cyclin A）和抗凋亡蛋白（如Bcl-xL、Mcl-1、Survivin）表达下调，最终引发白血病细胞的细胞周期G0/G1期阻滞和细胞凋亡。

本研究的科学价值与应用价值重大。在科学层面，它首次全面阐明了CADPE的抗白血病活性及其完整的作用机制，不仅揭示了肿节风抗白血病的药效物质基础之一，更重要的是发现了一种通过独特的上游调控机制间接靶向c-Myc蛋白稳定性的新模式。c-Myc被认为是“不可成药”靶点，直接靶向其转录功能困难重重。本研究为通过调控其蛋白稳定性来间接抑制c-Myc功能提供了新的思路和先导化合物。在应用层面，CADPE展现出高效、低毒、高选择性的特点，具有开发成为新型抗白血病药物的潜力，尤其是可能针对那些c-Myc高表达或异常活跃的白血病亚型。

本研究的亮点突出：第一，重要发现：明确了CADPE是一种通过独特机制（调控GSK3β/USP28/FBW7轴）促进c-Myc降解的新型高效抗白血病天然产物。第二，研究逻辑严谨：从表型（细胞活性、周期、凋亡）到靶点（c-Myc）再到具体机制（泛素化降解）及上游调控（GSK3β/USP28），层层递进，证据链完整，尤其是Co-IP实验提供了c-Myc泛素化的直接证据。第三，高选择性机制的合理解释：通过将药物敏感性与细胞c-Myc基础水平相关联，巧妙地解释了其对白血病细胞和正常细胞的选择性毒性，增加了其作为药物的潜在安全性。第四，研究的系统性与深度：不仅研究了CADPE本身，还通过与其他c-Myc抑制剂的对比，凸显了其作用机制的独特性和优越性。本研究是一份从天然产物中发现新机制、新靶点调控策略的典范之作。