Shangde Sun, Yaping Lv 与 Gaoshang Wang 来自河南工业大学食品科学与工程学院油脂技术工程系。他们的研究论文“Enhanced surfactant production using glycerol-based deep eutectic solvent as a novel reaction medium for enzymatic glycerolysis of soybean oil” 发表于 Elsevier 旗下的期刊 Industrial Crops & Products，卷 151，出版于 2020 年，文章在线发布于 2020 年 4 月 28 日。

该研究聚焦于食品科学与工程、生物催化及绿色化学领域。其核心背景在于二酰基甘油（Diacylglycerols，DAG）作为一种生物表面活性剂，在食品及日用化学品工业中作为添加剂具有重要价值，但天然油脂中含量极低（< 10%）。目前，以三酰基甘油（Triacylglycerols，TAG）与甘油进行甘油解反应是制备 DAG 最经济、最具工业前景的方法。然而，甘油与油脂的互溶性差是制约反应效率的关键瓶颈。传统方法通常引入有机溶剂（如叔丁醇、丙酮）来改善底物相容性，但这些溶剂对固定化脂肪酶的活性和稳定性有不利影响。因此，寻求一种既能改善底物互溶性、又能保持酶活性的绿色溶剂至关重要。在此背景下，低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents，DESs）的出现为这一难题提供了新思路。DESs 通常由氢键受体（Hydrogen-bond acceptors，HBAs，如氯化胆碱 ChCl）和氢键供体（Hydrogen-bond donors，HBDs，如甘油）混合形成，具有低成本、可生物降解、蒸汽压低、热稳定性好以及易于设计等优点，被认为是比离子液体更“绿色”的溶剂。先前研究还发现 DES 对脂肪酶具有较好的生物相容性，有助于维持其热稳定性和活性。本研究旨在克服传统方法的局限，首次将甘油基 DES 作为一种新型反应介质，用于增强固定化脂肪酶催化大豆油甘油解反应，以提高 DAG 的选择性产率，并评估其对酶稳定性及反应动力学的影响。

详尽的工作流程包括以下几个核心步骤：

1. 实验材料与准备： 研究使用了大豆油、甘油、三种固定化脂肪酶（Novozym 435， Lipozyme TL IM 和 Lipozyme RM IM）以及制备 DES 所需的氯化胆碱（ChCl）、甜菜碱（Bt）和乙胺盐酸盐（Et）。所有 DES 均通过将干燥的季铵盐（HBAs）与干燥的甘油（HBD）按特定摩尔比例混合，并在 80°C 下恒温磁力搅拌 2 小时制得，最终形成无色透明液体。例如，ChCl:2Gly 表示 ChCl 与甘油的摩尔比为 1:2。

2. 甘油基 DES 中的酶促甘油解反应： 将大豆油、甘油和特定配比的甘油基 DES 加入 25 ml 圆底烧瓶中，加热至设定温度后，加入固定化脂肪酶引发反应。反应过程中定期取样（100 µl），用正己烷溶解，并用无水硫酸钠去除水分，最终的正己烷相用于后续的气相色谱（GC）分析。这是研究的主要反应流程，所有参数优化均在此体系中进行。

3. 参数筛选与优化： 这是一个系统性实验过程，研究者设计了多个单因素实验来评估不同变量对反应的影响。首先，在五种 DES（ChCl:Gly, ChCl:2Gly, ChCl:3Gly, Bt:2Gly, Et:2Gly）和三种固定化脂肪酶（Novozym 435, Lipozyme TL IM, Lipozyme RM IM）中进行初步筛选，反应条件为：油/甘油摩尔比 1:2，酶负载量 10%（相对于油脂和甘油总重），温度 60°C，DES 用量 50%，反应 12 小时。结果显示 Novozym 435 和 ChCl:2Gly 体系效果最佳。在此基础上，研究者进一步详细评估了以下参数： * DES 负载量： 范围 0-50%（相对于油脂和甘油总重）。 * 反应温度： 范围 60°C – 120°C。 * 底物摩尔比（TAG/甘油）： 2:1， 1:2， 1:4， 1:6。 * Novozym 435 酶负载量： 3%， 5%， 8%， 12%（相对于底物总重）。 * 外加水量： 0-5%（基于甘油质量）。 每个实验均通过 GC 分析产物组成，并计算 TAG 转化率、DAG 产率、单酰基甘油（MAG）产率、游离脂肪酸（FFA）产率以及 DAG 选择性（S(dag)）。

4. 酶的重复使用性实验： 为了评估 DES 体系的经济性，考察了 Novozym 435 的重复使用性能。反应结束后，用正己烷溶解混合物，通过水洗和抽滤回收固定化酶，在 60°C 下干燥 2 小时后，将其加入装有新底物的反应体系中开始新一轮反应。酶活性通过 DAG 产率的变化来评估。

5. 动力学与热力学研究： 在确定最佳条件后，研究者进行了深入的机理探讨。通过测定不同温度下的初始反应速率，利用阿伦尼乌斯方程计算了 TAG 转化、DAG 形成和 MAG 形成的活化能。此外，基于“乒乓 Bi-Bi”机制并考虑底物抑制，通过改变大豆油浓度（保持甘油量恒定），测量初始反应速率，利用 Lineweaver-Burk 双倒数作图法计算了表观米氏常数（K’m）和最大反应速率（Vmax）。

6. 数据分析方法： 所有实验均重复 2-3 次，实验数据使用 SPSS 20.0 软件进行处理和分析。结果以平均值 ± 标准偏差表示，并使用方差分析（ANOVA）检验显著性差异（p < 0.05）。

研究的主要结果如下：

1. 脂肪酶与 DES 的筛选： Novozym 435 在所有测试的 DES 体系中均表现出最高的催化活性，TAG 转化率达到 40-60%，显著高于 Lipozyme RM IM 和 Lipozyme TL IM（<12%）。这表明 Novozym 435 在 DES 体系中的酰基转移能力更强，可能与它独特的空间结构、催化特性以及与 DES 的良好相容性有关。因此，Novozym 435 被选定为后续研究的催化剂。

2. DES 体系的影响： 在无溶剂体系中，TAG 转化率最高（68.61%），但 DAG 选择性仅为 0.52。而在 DES 体系中，虽然 TAG 转化率略低，但 DAG 选择性显著提高至 0.70-0.78。这证明了 DES 有利于 DAG 的选择性形成。在五种 DES 中，ChCl:2Gly 体系获得了最高的 TAG 转化率（50.27%）和最高的 DAG 选择性（0.78），被确定为最佳反应介质。研究进一步发现，在相同 HBD（甘油）下，不同 HBA 形成的 DES 对 DAG 选择性的影响顺序为 ChCl:2Gly = Et:2Gly > Bt:2Gly > 对照。研究者将此现象归因于 DES 中氢键的存在增强了反应体系极性，促进了反应物中 -OH 的解离，从而提高了 DAG 选择性；但过强的氢键也可能破坏脂肪酶的空间结构，导致 TAG 转化率下降。此外，研究了 ChCl 与甘油不同摩尔比（1:1, 1:2, 1:3）的影响，结果表明 ChCl:2Gly 在 DAG 产率、选择性和初始反应速率方面均表现最佳，过多的甘油（如 1:3）反而会降低 DAG 选择性，因为更有利于 MAG 的形成。

3. 反应参数优化结果： 通过一系列单因素实验，获得了最优化的反应条件。 * DES 负载量： 10% 为最佳。此时 DAG 产率最高（48.21%），选择性为 0.70。过高的 DES 负载（如 50%）会稀释底物和酶浓度，且亲水的 DES 可能附着在酶表面阻碍底物接触活性位点，导致反应速率和产率下降。 * 反应温度： 80°C 为最佳温度。在此温度下 TAG 转化率最高（74.92%），DAG 产率（约 49%）和选择性（0.65-0.69）在 60-120°C 范围内变化不大。值得注意的是，即使在 120°C 高温下，TAG 转化率仅轻微下降，而传统溶剂体系通常因酶失活导致转化率显著降低。这证明了 DES 对 Novozym 435 在高温下具有良好的保护作用，使其热稳定性增强。 * 底物摩尔比： TAG/甘油 = 1:4 为最佳。此时 DAG 产率（51.97%）和 TAG 转化率（约 76.45%）均接近最高，同时 DAG 选择性（0.66）高于 1:2 和 1:6 的比率。甘油过量过多（如 1:6）会导致其覆盖酶的活性位点，阻碍反应物碰撞，反而降低效率。 * 酶负载量： 8% 为最佳。反应在 8 小时内达到平衡，TAG 转化率为 75.77%，DAG 产率为 49.83%。继续增加至 12% 对产率和转化率没有明显提升，可能是由于酶聚集成团，阻碍了活性位点的暴露。 * 外加水量： 不加水效果最佳。无外加水的体系 DAG 产率（49.83%）和选择性（0.65）最高。添加水会破坏 ChCl:2Gly 与甘油之间形成的氢键，并促进 TAG 和 DAG 的水解，生成更多游离脂肪酸，从而降低 DAG 的产率和选择性。

4. 酶的重复使用性： 在 ChCl:2Gly 体系中，Novozym 435 重复使用 5 次后，其催化活性仅下降 2%。第 6 次使用时，DAG 产率下降 8%，剩余活性约为初始活性的 84.1%。这表明该 DES 体系能较好地维持酶的重复使用性，尽管略逊于无溶剂体系（可重复使用 10 次），这可能与 DES 的较高粘度以及 ChCl 对酶活性的轻微抑制有关。

5. 热力学与动力学结果： 热力学分析表明，DAG 形成的活化能（20.30 kJ/mol）低于 MAG 形成的活化能（22.68 kJ/mol），这从能量角度解释了 ChCl:2Gly 体系有利于 DAG 选择性生成的原因。TAG 转化的活化能为 27.80 kJ/mol。动力学研究确定了反应符合“乒乓 Bi-Bi”机制并存在底物抑制。在优化的底物比例下，计算得到表观米氏常数 K’m 为 1.35 mol/L，最大反应速率 Vmax 为 7.9 × 10⁻² mol/(L·min)。

研究的结论是： 本研究成功地将甘油基 DES 作为一种新型绿色溶剂，用于 Novozym 435 催化大豆油甘油解选择性制备 DAG。在以 ChCl:2Gly 为 DES、Novozym 435 为催化剂、在 80°C、TAG/甘油摩尔比 1:4、酶负载量 8%、DES 负载量 10%、无外加水的条件下反应 8 小时，可获得最高的 DAG 产率（49.83%）和 TAG 转化率（75.80%）。该 DES 体系能显著提高 DAG 的选择性（0.64-0.78），并能在一定程度上保护酶在高温下的活性，使其可重复使用 5 次而活性无显著损失。研究还从热力学（较低的 DAG 形成活化能）和动力学参数上为反应机理提供了支撑。

本研究的科学与应用价值： 科学价值在于首次系统地将甘油基 DES 应用于酶促甘油解制备 DAG 的体系，拓展了 DES 在油脂改性及生物催化领域的应用范围。研究揭示了 DES 通过调节体系极性和氢键环境，不仅能改善疏水底物的相容性，还能影响反应路径，提高目标产物 DAG 的选择性，并增强固定化酶的操作稳定性（尤其是热稳定性）。应用价值在于提供了一种环境友好、高效、选择性强的 DAG 绿色制备工艺，避免了传统有机溶剂的使用，为食品和日化行业生产高附加值乳化剂提供了有潜力的技术路线。

研究的亮点在于： 1) 方法新颖性： 首次将甘油基 DES 作为反应介质用于酶促甘油解制备 DAG，为解决底物互溶性问题提供了创新性的绿色解决方案。2) 显著的效果： 在提高 DAG 选择性方面效果突出，同时发现 DES 能保护酶在相对高温（高达 120°C）下的活性，突破了传统酶法反应对温度的限制。3) 系统性研究： 不仅优化了工艺参数，还深入进行了热力学和动力学分析，为理解 DES 在该反应中的作用机制提供了理论基础。4) 绿色可持续： 所使用的 DES 原料廉价、可生物降解，整个工艺契合绿色化学和可持续发展的理念。

其他有价值的内容： 研究通过方差分析（ANOVA）指出，各参数对 DAG 产率影响的显著性顺序为：酶负载量 > TAG/甘油摩尔比 > DES 负载量 > 反应温度。这为未来工艺放大和关键控制点的确定提供了重要参考。