这是一项关于成纤维细胞生长因子9（fibroblast growth factor 9, FGF9）调控骨髓间充质干细胞命运及骨质疏松中骨-脂肪平衡的原创性研究。该研究由Mingmei Chen、Hui Liang、Min Wu、Haoyang Ge、Yan Ma、Yan Shen、Shunyuan Lu、Chunling Shen、Hongxin Zhang、Zhugang Wang及Lingyun Tang等人完成。主要研究机构包括上海交通大学医学院附属瑞金医院医学基因组学国家重点实验室、实验医学研究中心、上海血液学研究所及瑞金医院卢湾分院。该论文发表于 *International Journal of Biological Sciences*，2024年第20卷第9期，DOI为10.7150/ijbs.94863，于2024年6月17日正式发表。
骨骼稳态的维持依赖于成骨细胞与脂肪细胞之间的精细平衡。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）作为成骨细胞和脂肪细胞的共同祖细胞，其分化命运决定了骨量与骨髓脂肪组织（bone marrow adipose tissue, BMAT）的相对比例。在骨质疏松和骨骼衰老过程中，BMSCs向脂肪细胞分化增多、向成骨细胞分化减少，导致骨量下降和骨髓脂肪堆积。然而，调控BMSCs命运决定的确切机制仍不明确。FGF家族在骨稳态维持中发挥重要作用，既往研究提示FGF9在骨骼发育和骨量调控中具有功能，但其对成人骨稳态及BMSCs谱系定向的调控机制尚未完全阐明。本研究的目的是明确FGF9是否通过调控BMSCs的成骨/成脂分化命运来影响骨-脂肪平衡，并探索其下游信号通路。
研究采用了多种实验体系和模型，主要包括FGF9功能缺失突变小鼠（FGF9S99N）、卵巢切除（ovariectomy, OVX）诱导的骨质疏松模型、体外BMSCs培养与分化实验、RNA测序、信号通路抑制实验以及体内移植实验。首先，通过单细胞转录组公共数据分析发现FGF9主要表达于骨髓微环境中的成纤维细胞亚群，其受体FGFR1主要表达于成纤维细胞、软骨细胞和间充质干细胞；同时，衰老小鼠和OVX小鼠骨组织中FGF9的mRNA和蛋白水平显著上升。接着，研究者利用FGF9S99N突变小鼠进行组织形态学分析，发现4月龄突变小鼠股骨和胫骨中骨髓脂肪细胞数量显著减少，新生成骨标志物表达升高。为进一步评估FGF9在骨质疏松中的作用，对野生型和杂合突变小鼠进行卵巢切除手术。Micro-CT分析显示，OVX导致野生型小鼠骨小梁和皮质骨显著丢失，而携带FGF9S99N突变的小鼠对OVX诱导的骨丢失具有显著抗性，骨密度、骨小梁数目、骨表面密度等参数明显优于OVX野生型小鼠，骨小梁分离度降低。血清I型前胶原氨基端前肽（PINP）水平在OVX杂合突变小鼠中显著升高，表明成骨活性增强；而血清I型胶原交联羧基末端肽（CTX-I）水平和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色在两组间无显著差异，提示FGF9突变主要通过促进成骨而非抑制破骨来改善OVX引起的骨丢失。组织学染色显示OVX野生型小鼠骨髓脂肪明显增多，而杂合突变小鼠的BMAT积累显著减轻。免疫荧光染色进一步证实突变小鼠骨髓中脂滴标志物Perilipin A/PLIN1减少，骨标志物骨桥蛋白（OPN）增多。
在体外实验中，研究者从骨密质中分离并鉴定了BMSCs，流式细胞术检测显示细胞表达CD29、CD44、Sca-1和CD140a等阳性标志物，而不表达CD31、CD34、CD45和Ter-119。来自20月龄FGF9wt/mut小鼠的BMSCs在成脂诱导后油红O染色阳性的成熟脂肪细胞数量显著低于野生型，而在成骨诱导后矿化结节形成显著增加；成脂基因Cebpa、Pparg、Adipoq表达降低，成骨基因Runx2、Osterix、Alpl表达升高。为直接证明FGF9的作用，使用不同浓度的重组FGF9蛋白处理1月龄野生型小鼠BMSCs。结果表明FGF9以剂量依赖性方式抑制成骨分化和矿化，并促进脂肪细胞形成；即使在成骨诱导条件下，高浓度FGF9也能驱动BMSCs向脂肪细胞分化。qRT-PCR和Western blot分析证实FGF9下调成骨基因和蛋白表达，上调成脂基因和蛋白表达。此外，通过慢病毒介导FGF9在BMSCs中稳定过表达，体外和裸鼠皮下移植实验均显示FGF9过表达BMSCs在体内更倾向于向脂肪组织分化，而非骨组织，进一步证实FGF9在体内对BMSCs命运调控的作用。
为明确FGF9作用的阶段特异性，研究者在BMSCs分化的不同时间点给予FGF9刺激。结果显示，FGF9在分化早期（前2天）对成脂分化的促进和对成骨分化的抑制作用最强，随着刺激时间推迟其效应逐渐减弱。预先用FGF9处理BMSCs两天后再进行成骨或成脂诱导，仍能显著抑制成骨和促进成脂，提示FGF9主要在细胞命运决定阶段发挥作用。长期FGF9刺激或FGF9过表达甚至在普通培养基中即可诱导BMSCs自发向脂肪细胞分化，同时碱性磷酸酶（ALP）活性下降。
为阐明分子机制，研究者对在普通培养基（CM）、成骨诱导（OI）和成脂诱导（AI）条件下加或不加FGF9处理4天的BMSCs进行RNA测序。差异表达基因的基因本体（GO）富集分析显示，FGF9处理组中脂肪细胞分化、脂质代谢相关基因显著上调，而细胞外基质组织、骨化、生物矿化和成骨细胞分化相关基因显著下调。KEGG通路富集分析共鉴定出250个共同上调基因和340个共同下调基因，主要涉及PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Hippo信号通路、TGF-beta信号通路等。进一步的抑制剂实验表明，FGFR抑制剂（BGJ398）、PI3K抑制剂（BEZ235）、Akt抑制剂（MK-2206）以及Hippo通路抑制剂（XMU-MP-1）均可显著逆转FGF9对成脂基因表达的上调作用；而FGFR抑制剂和MEK抑制剂（U0126）可逆转FGF9对成骨基因表达的下调作用。受体选择性抑制剂实验显示FGFR1抑制剂显著阻断FGF9对BMSCs分化命运的影响，而FGFR2抑制剂无显著效应。Western blot分析显示FGF9在成脂诱导条件下增强Akt和YAP1磷酸化，在成骨条件下增强ERK和YAP1磷酸化，在普通培养基中同时增强ERK、Akt和YAP1磷酸化。此外，PI3K/Akt抑制剂预处理可减弱FGF9诱导的YAP1磷酸化，提示PI3K/Akt/Hippo通路在FGF9促脂肪分化中形成级联调控，而MEK/ERK通路则介导FGF9对成骨分化的抑制。
该研究的结论是：FGF9是骨髓微环境中调控成人骨内骨-脂肪平衡的关键细胞因子。FGF9通过FGFR1激活PI3K/Akt/Hippo信号通路促进BMSCs向脂肪细胞分化，并通过MEK/ERK信号通路抑制BMSCs向成骨细胞分化。FGF9在衰老和OVX诱导的骨质疏松骨中表达上调，其功能缺失突变可显著抑制骨髓脂肪形成并减轻骨丢失。本研究首次揭示了FGF9通过直接调控BMSCs分化命运来调节骨-脂肪平衡的机制，为骨质疏松的治疗提供了新的潜在靶点。
该研究的亮点在于：首次证明FGF9在成人骨髓微环境中参与BMSCs命运决定；利用FGF9S99N功能缺失突变小鼠模型并结合OVX骨质疏松模型，从体内和体外两个层面系统阐明了FGF9对骨-脂肪平衡的调控作用；通过转录组学、信号通路抑制实验和蛋白磷酸化分析，揭示了FGF9在不同分化条件下选择性激活MEK/ERK和PI3K/Akt/Hippo通路。研究还提示FGF9可能作为治疗骨质疏松的新靶点，具有重要的科学意义和临床应用前景。