本文介绍了一项关于黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）在肿瘤形成与恶性进展中作用机制的研究，由Gordon W. McLean、Noboru H. Komiyama、Bryan Serrels、Hidefumi Asano、Louise Reynolds、Francesco Conti、Kairbaan Hodivala-Dilke、Daniel Metzger、Pierre Chambon、Seth G.N. Grant以及Margaret C. Frame等人合作完成。主要研究机构包括英国格拉斯哥的The Beatson Institute for Cancer Research、University of Glasgow、Wellcome Trust Sanger Institute、University of Edinburgh、The London Queen Mary’s School of Medicine and Dentistry以及法国斯特拉斯堡的Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire。该论文于2004年发表在Genes & Development杂志上，文章标题为“Specific deletion of focal adhesion kinase suppresses tumor formation and blocks malignant progression”。
这项研究属于肿瘤生物学与信号转导领域，重点关注细胞黏附相关信号分子在肿瘤发生与发展中的功能。细胞与胞外基质之间的黏附结构被称为黏着斑（focal adhesions），这些结构不仅提供物理连接，还通过整合素受体向细胞内传递生存和增殖信号。FAK是黏着斑中的重要非受体酪氨酸激酶，参与调控整合素介导的细胞黏附、迁移、增殖和生存。以往大量研究表明FAK表达水平与多种人类癌症的发生和恶性程度相关，但在整体动物水平上一直没有直接实验证据证明FAK在肿瘤形成和恶性进展中具有因果关系。由于FAK基因组成性敲除会导致胚胎致死，难以在成体动物中直接研究其在肿瘤进展中的作用。因此，本研究的主要目标是利用条件性基因敲除技术，在时间和空间上精确控制FAK的缺失，以明确FAK在化学诱导皮肤肿瘤形成以及良性乳头状瘤向恶性鳞状细胞癌转化过程中的功能。
为了实现这一目标，研究者构建了携带floxed FAK等位基因的小鼠，并使其同时表达由角蛋白14（keratin-14，K14）启动子控制的CreERT2重组酶。CreERT2是一种融合了改良雌激素受体的Cre重组酶，只有在4-羟基他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen，4-OHT）存在时才具有活性。由于K14启动子主要在表皮角质形成细胞中活跃，因此该系统能够实现FAK在表皮及毛囊等皮肤上皮组织中的特异性诱导性敲除。基因打靶策略是在FAK基因中编码激酶结构域部分氨基酸（413–444位）的外显子两侧插入loxp位点。Cre介导的重组不仅删除该外显子，还在相邻外显子中引入移码突变，从而完全阻止功能性FAK蛋白的产生。通过免疫印迹检测确认，在Cre重组酶表达后，细胞中检测不到FAK蛋白。将FAKflox/flox小鼠与K14CreERT2转基因小鼠交配，获得的K14CreERT2/FAKflox/flox小鼠在给予4-OHT后，表皮中FAK表达被有效抑制，而肾脏和脾脏等其他组织中的FAK表达不受影响。免疫组织化学分析进一步证明，4-OHT处理后，表皮和毛囊中的FAK表达明显下降，而真皮中仍保持FAK表达。
在证明该条件性基因敲除系统有效后，研究者在化学致癌实验中观察FAK缺失对肿瘤形成的影响。研究采用小鼠皮肤两阶段化学致癌模型：首先用致癌剂7,12-二甲基苯并蒽（7,12-dimethylbenzanthracene，DMBA）诱导c-Ha-ras基因激活突变，然后用肿瘤促进剂12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA）持续处理20周，以诱导良性乳头状瘤形成，其中一部分乳头状瘤会进一步发展为侵袭性鳞状细胞癌。实验结果显示，在4-OHT处理的K14CreERT2/FAKflox/flox小鼠中，只有50%的小鼠在12周内形成乳头状瘤，而未处理组小鼠则在相同时间点100%形成乳头状瘤。更为重要的是，在22周时，4-OHT处理组小鼠平均形成的乳头状瘤数量显著低于未处理组。对照组实验显示，Cre表达或4-OHT处理本身对肿瘤形成没有影响，排除了实验体系中其他因素的干扰。这部分结果表明FAK在Ras依赖的化学诱导乳头状瘤形成中发挥调节作用，FAK缺失可显著抑制肿瘤发生效率。
进一步研究中，作者直接探究FAK是否在良性肿瘤向恶性癌的转化过程中发挥因果作用。实验设计为：先让K14CreERT2/FAKflox/flox小鼠接受DMBA和TPA处理，在15周时大多数乳头状瘤已经形成后，再给予4-OHT诱导FAK缺失。免疫组织化学显示，4-OHT处理后，乳头状瘤中增生上皮区域的FAK染色明显消失，证实了在已形成的良性肿瘤中成功删除了FAK基因。统计学分析表明，在未处理组中，4.1%的乳头状瘤转化为鳞状细胞癌，而在4-OHT处理组中，恶性转化率显著降低至0.6%。作为对照，4-OHT处理的FAKflox/flox小鼠的转化率为3.9%，排除了4-OHT处理本身对转化率的影响。值得注意的是，在4-OHT处理组中仅有的两例鳞状细胞癌经免疫印迹检测发现仍保留FAK表达，说明这两例肿瘤来自于未成功敲除FAK的乳头状瘤。也就是说，在所有FAK真正缺失的乳头状瘤中，没有一例进展为鳞状细胞癌。这表明FAK缺失与恶性进展不相容，FAK在良性乳头状瘤向恶性鳞状细胞癌的转化过程中具有必需作用。
为了进一步理解FAK缺失抑制肿瘤形成和恶性转化的机制，研究者从K14CreERT2/FAKflox/flox小鼠中分离原代角质形成细胞进行体外功能实验。免疫荧光染色显示，未处理角质形成细胞中FAK主要分布于细胞外周，提示其定位于黏着斑；4-OHT处理后，大部分细胞的外周FAK染色消失。体外伤口愈合实验中，4-OHT处理后的FAK缺陷角质形成细胞无法在48小时内重新覆盖划痕区域，而对照组细胞则能正常完成伤口愈合。通过时间延迟显微技术追踪单个细胞运动，发现FAK缺失角质形成细胞的迁移速度降低了约50%，但细胞仍保持一定的运动能力。此外，在伤口边缘的汇合区域，FAK缺陷细胞数量也较少，提示在FAK缺失条件下不仅有迁移障碍，还存在细胞脱落或死亡增加的问题。流式细胞术分析发现，4-OHT处理后，FAK缺失角质形成细胞中具有亚二倍体DNA含量的细胞比例显著增加，说明细胞死亡水平升高。因此，FAK缺失会导致角质形成细胞迁移能力下降，并引起细胞凋亡增加。
为了进一步区分究竟是细胞迁移缺陷还是细胞凋亡增加在体内抑制肿瘤形成中起主导作用，研究者进行了体内创伤愈合实验和凋亡检测。通过3毫米打孔活检制造皮肤创伤，比较4-OHT处理和未处理小鼠的伤口愈合情况。结果显示，两组小鼠在伤后7天均基本完成再上皮化，且在第1天和第3天也未观察到愈合延迟。这表明，虽然FAK缺失在体外降低了角质形成细胞迁移速度，但在体内并不足以显著影响伤口再上皮化过程。与之相比，免疫组织化学检测活化的caspase-3作为细胞凋亡标志物发现，4-OHT处理小鼠的皮肤和乳头状瘤中，活化caspase-3阳性细胞数量明显增加。特别是毛囊区域中凋亡信号最为明显，而毛囊被认为是DMBA诱导皮肤肿瘤发生的主要靶细胞来源。此外，从已形成的良性乳头状瘤中删除FAK后，肿瘤组织中的凋亡染色也明显增强。这些结果说明，FAK在体内对肿瘤形成和恶性进展的关键作用更依赖于其促进细胞生存的功能，而不是单纯通过调控细胞迁移来实现的。
本研究的结论是，FAK在化学诱导皮肤肿瘤形成和恶性进展中起因果作用。这是首次在整体动物水平上提供直接实验证据，证明FAK参与肿瘤发生，并且其主要机制与增强细胞生存、抑制细胞凋亡有关。在体外实验中，FAK缺失虽然能够降低角质形成细胞迁移能力，但在体内创伤愈合过程中并未观察到显著影响，说明FAK对肿瘤的调控作用可能更多体现在细胞生存信号通路上。该研究为FAK作为抗肿瘤治疗靶点提供了重要的理论支持。由于FAK在恶性进展中具有关键作用，同时肿瘤细胞中FAK表达通常升高，因此针对FAK的干预策略可能有助于抑制肿瘤进展和扩散。从方法学角度看，本研究展示了一种条件性、可诱导的基因敲除策略，成功避开了FAK组成性敲除导致胚胎致死的问题，使得研究者能够在肿瘤形成前和形成后分别干预FAK表达，从而分别评估其在肿瘤发生与恶性转化中的功能。这是该研究在实验设计和方法上的重要创新之处。
本研究的亮点主要包括：首次利用时空可控的条件性基因敲除系统，在完整动物体内证明FAK在肿瘤形成和恶性进展中的因果作用；采用肿瘤已形成后再诱导基因敲除的策略，明确区分了FAK在良性肿瘤形成阶段和恶性转化阶段的不同功能；发现FAK的作用机制与促进细胞生存、抑制细胞凋亡密切相关，而其对细胞迁移的影响在体内肿瘤模型中并非主导因素。以上发现不仅丰富了黏着斑信号通路在肿瘤生物学中的认识，也为以后开发以FAK为靶点的抗肿瘤治疗策略提供了实验依据。