研究报道：BRAF V600E突变结直肠癌的亚型及其分子特征分析

该研究由David Barras等研究者带领，主要合作者包括Edoardo Missiaglia、Pratyaksha Wirapati、Oliver M. Sieber、Robert N. Jorissen及其他多位专家，研究单位涉及瑞士生物信息学研究所（Swiss Institute of Bioinformatics）、Walter and Eliza Hall医学研究所等多家机构。这项研究发表在2017年1月1日《Clinical Cancer Research》杂志上，题为“BRAF V600E Mutant Colorectal Cancer Subtypes”。

背景与研究目的

研究科学领域与背景
该研究聚焦于结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC），这是一种全球范围内导致癌症相关死亡的主要病因，而BRAF V600E基因突变出现在约10%的结直肠癌中。BRAF V600E是一种导致RAF蛋白异常激活的突变形式，激活MAPK信号通路，加速细胞异常增殖和癌变。尽管近年来抗BRAF靶向疗法以及联合MEK、EGFR抑制剂的研究取得一定进展，但BRAF V600E突变的结直肠癌患者的治疗效果仍显极不均一，因此理解其生物学异质性以及潜在的亚型划分成为关键问题。

研究目的
本研究在迄今为止关于BRAF V600E突变结直肠癌的最大样本量的基础上，通过基因表达数据进行聚类分析，探讨该群体内部的潜在分子亚型及其通路激活特征，为药物靶向治疗提出新的思路和方向。

研究流程与方法

总体流程
研究主要包括以下几部分内容和方法：数据收集与样本构建、基因表达分析与聚类、分子特征分析（包括通路富集和蛋白组确认）、亚型与临床变量的关联研究、生存分析和药物敏感性预测。

1. 数据收集与样本构建

研究样本来源于八个独立队列，包括The Cancer Genome Atlas(TCGA)，PETACC-3临床试验，以及Agendia、ICO、VHB等公开或内部数据集，总共收集了218例BRAF V600E突变的结直肠癌患者样本。研究使用了标准化和批次校正的方法，确保不同数据集之间的可比性。最终处理后的数据集包含9,328个基因的表达信息，用于后续分析。

2. 基因表达分析与聚类

为了探讨样本基因表达的内部结构，研究使用无监督非负矩阵因子分解（Non-negative Matrix Factorization, NMF）方法对218份样本进行聚类分析。通过比较不同因子分解等级的聚类质量指标（如Cophenetic相关系数和平均轮廓宽度），确定最佳分组数为两个亚型，分别命名为BM1（BRAF mutant 1）和BM2（BRAF mutant 2）。BM1和BM2亚型的样本比例约为1:2。

3. 分子通路与生物过程分析

研究通过单样本基因集富集分析方法（Single-Sample Gene Set Enrichment Analysis, ssGSEA）探讨两个亚型的分子通路活性。分别使用特定的数据库（MSigDB）的签名基因集，研究每个亚型在关键生物过程中的特征。此外，通过蛋白组学数据（TCGA反向相位蛋白阵列，RPPA）验证核心通路活性。

4. 临床变量与亚型的关系分析

药物敏感性分析基于癌细胞系百科全书（Cancer Cell Line Encyclopedia, CCLE）和Sanger研究数据，研究了不同亚型在多种标准化抗癌药物处理下的差异性。

研究结果

1. 亚型特征

• BM1亚型：聚类分析和通路研究显示，BM1亚型表现出显著的KRAS/AKT/MTOR/4EBP信号通路的激活，同时伴随免疫浸润标志和上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）的活跃。该亚型患者的蛋白组学数据进一步证明AKT磷酸化和4EBP1磷酸化水平较高。

• BM2亚型：BM2亚型则具有细胞周期和检查点失调的分子特征，显著富集与细胞周期调控相关的通路（如E2F转录因子靶基因）。其蛋白组验证结果表明CDK1蛋白水平较高，而其他细胞周期调控蛋白Cyclin D1水平较低。

2. 临床变量关联

BM1和BM2亚型的划分独立于MSI状态、PI3K突变、性别及肿瘤发生位置。尽管BM2亚型中MSI高频率相对显著，但它不会主导亚型间基因表达的差异。

3. 生存结果

生存分析中发现，BM1亚型趋势表现为较差的总体生存率和无复发生存期，尽管其在统计学上尚未达到显著性水平。这可能与BM1亚型中MSS患者的富集有关。

4. 药物敏感性

药物敏感性预测发现： - BM1亚型可能对BRAF抑制剂（如PLX4720）、MEK抑制剂及AKT抑制剂更敏感。 - BM2亚型则对细胞周期相关药物，如CDK1抑制剂呈现一定敏感性。

研究结论与意义

研究首次基于基因表达差异对BRAF V600E突变结直肠癌患者进行了分子分型，并将其分为BM1和BM2两个亚型。这一分型有助于解释该患者群体内部异质性以及治疗反应差异。研究指出BM1亚型更多地涉及KRAS/MTOR/AKT信号通路以及免疫相关特征，适合作为靶向药物开发的重点。而BM2亚型则因其特有的细胞周期失调特征，可能受益于细胞周期相关的治疗策略。

此外，研究为精准治疗方案的设计提出了新思路，尤其是在组合靶向治疗的优化中具有重要意义，例如联合BRAF、MEK和CDK1抑制剂的潜力。

亮点与创新

1. 大样本量：该研究分析了迄今为止最大规模的BRAF V600E突变结直肠癌患者数据，具有重要代表性。
2. 首次分型：明确提出BM1和BM2两个分子亚型，并系统揭示它们的特异性通路特征。
3. 多层次验证：研究不仅通过基因表达分析，也使用蛋白组和药物敏感性数据进行了多层面的结果验证。

研究展示了转录组分析在揭示癌症异质性以及发展精准治疗策略中的巨大潜力。这一工作为将来更深入的机制研究和临床试验提供了坚实的科学依据。