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NEAT1 lncRNA的结构分析揭示其长程RNA相互作用对paraspeckle架构的贡献

作者及单位：
本研究由Carnegie Mellon University的Yizhu Lin（第一作者）、Brigitte F. Schmidt、Marcel P. Bruchez及C. Joel McManus（通讯作者）团队完成，发表于2018年1月31日的《Nucleic Acids Research》期刊（Volume 46, Issue 7, Pages 3742–3752），DOI: 10.1093/nar/gky046。

学术背景

研究领域：
本研究聚焦于长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）的结构与功能，具体探讨了lncRNA NEAT1（Nuclear-Enriched Abundant Transcript 1）的二级结构及其在核体paraspeckle形成中的支架作用。

研究动机：
lncRNA在基因调控中具有多样性功能，但其序列保守性普遍较低，暗示其功能可能依赖于高阶结构（如二级或三级结构）的保守性。NEAT1是paraspeckle（一种核内无膜细胞器）的核心组成成分，其5’和3’端定位于paraspeckle外围，而中部序列位于核心区。这种空间分布提示NEAT1可能通过RNA-RNA相互作用或RNA-蛋白质相互作用维持paraspeckle的架构。然而，NEAT1的具体结构特征及其进化保守性尚不明确。

研究目标：
1. 解析人类和小鼠NEAT1短异构体（NEAT1_s）的二级结构模型；
2. 比较物种间NEAT1结构的保守性；
3. 探索NEAT1长异构体（NEAT1_l）的5’与3’端是否存在长程相互作用；
4. 阐明NEAT1结构对paraspeckle架构的潜在贡献。

研究流程与方法

1. NEAT1_s的体外结构解析

实验对象：
- 人类NEAT1_s（hNEAT1_s，3735 nt）和小鼠NEAT1_s（mNEAT1_s）。
- 样本处理：通过非变性纯化保留RNA的共转录折叠状态，避免热变性导致的异质性结构。

实验方法：
- SHAPE化学探测：使用1M7试剂（1-methyl-7-nitroisatoic anhydride）标记RNA的柔性单链区域，通过Mod-Seq（高通量测序技术）检测修饰位点，生成单核苷酸分辨率的SHAPE反应性图谱。
- 分段分析（3S shotgun方法）：将全长hNEAT1_s分为13个重叠的500 nt片段，分别进行SHAPE探测，比较片段与全长RNA的结构一致性，以鉴定稳定局部结构域。
- 结构建模：利用RNAstructure软件（v5.8.1）基于SHAPE数据预测最小自由能结构和最大期望结构。

创新方法：
- 非变性纯化流程：优化自Somarowthu等人（2015）的方法，确保RNA保持天然构象。
- 1M7合成改进：开发了新的1M7合成工艺，产物纯度更高（通过核磁共振验证）。

2. 结构保守性分析

• 系统发育比较：使用Infernal软件对64种哺乳动物的NEAT1_s序列进行多序列比对，通过R2R和R-scape分析共变碱基对（covarying base pairs）。
  
• 合成随机序列对照：生成模拟突变序列（突变率0.5%-5%），评估共变分析的假阳性率。
  

3. 长程相互作用验证

• 计算预测：使用RNAduplex预测hNEAT1_l的5’端（与hNEAT1_s序列相同）与3’端（19,006 nt）的相互作用区域。
  
• 体外凝胶迁移实验：设计预测的相互作用片段（如hNEAT1的282–546 nt与20761–21120 nt），在生理Mg²⁺浓度下验证RNA双链体形成。
  

4. RNA结合蛋白定位

• eCLIP数据分析：整合ENCODE项目中160种RNA结合蛋白的结合位点数据，分析TARDBP（一种paraspeckle外围蛋白）等蛋白与NEAT1的相互作用区域。
  

主要研究结果

1. hNEAT1_s的模块化结构

• 四结构域模型：hNEAT1_s折叠为四个独立结构域（Domain I-IV），其中Domain I覆盖5’端，Domain IV位于3’端，Domain II/III位于中部（图2d）。
  
• 局部稳定性：分段SHAPE数据显示，57.7%的碱基对在片段与全长RNA中一致，支持局部结构的独立性。
  

2. 有限的物种间结构保守性

• 保守区域：仅少数短区域（如hNEAT1_s的514–680 nt）在人类与小鼠间SHAPE反应性显著相关（r=0.43），但R-scape未检测到显著共变碱基对。
  
• 进化意义：NEAT1的功能保守性可能依赖于局部单链区域的保守性，而非全局二级结构。
  

3. 长程RNA-RNA相互作用

• 计算预测：hNEAT1_l的5’端与3’端存在强相互作用潜能（ΔG < -30 kcal/mol），小鼠中类似（图4a-d）。
  
• 实验验证：凝胶迁移实验证实hNEAT1的282–546 nt与20761–21120 nt片段在体外形成双链体（图4e）。
  

4. 与paraspeckle架构的关联

• TARDBP结合位点：eCLIP数据显示TARDBP结合于NEAT1_s的5’和3’端附近，与预测的长程相互作用区域相邻（图5）。
  
• 模型提出：NEAT1_l通过5’-3’端自身环化或与NEAT1_s互作，形成paraspeckle的环形骨架，蛋白质结合进一步稳定该架构。
  

结论与意义

科学价值：
1. NEAT1结构模型：首次提供hNEAT1_s的二级结构框架，揭示其模块化特征。
2. 功能保守机制：NEAT1的功能保守性可能依赖局部结构或RNA-蛋白质互作，而非序列或全局结构。
3. paraspeckle形成假说：长程RNA相互作用与蛋白质定位共同维持paraspeckle的空间组织。

应用潜力：
- 为理解lncRNA的结构-功能关系提供范例；
- 对癌症（如NEAT1在多种肿瘤中异常表达）和神经退行性疾病的机制研究具有启示意义。

研究亮点

1. 技术创新：改进的1M7合成与非变性纯化方法提升了SHAPE数据的准确性。
   
2. 跨物种分析：结合计算与实验验证，阐明lncRNA结构保守性的独特性。
   
3. 理论突破：提出NEAT1通过长程相互作用支架paraspeckle的新模型，挑战了传统蛋白质主导的核体组装观点。
   

其他有价值内容

• PARIS数据支持：第三方研究（Lu et al., 2016）的体内RNA互作数据与本研究预测的部分相互作用一致（如hNEAT1_l的3172–3190 nt与21219–21264 nt配对）。
  
• 局限性：体外实验无法完全模拟细胞内环境（如蛋白质结合对RNA结构的影响）。
  

（全文约2000字）