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多环芳烃单羟基代谢物的在线固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法定量研究

第一作者及机构
本研究由美国疾病控制与预防中心（CDC）国家环境健康中心实验室科学部的Yuesong Wang、Lei Meng等团队完成，发表于*Analytical and Bioanalytical Chemistry*期刊，2016年9月接受。

学术背景
多环芳烃（PAHs）是广泛存在的环境污染物，与多种健康危害（如致癌性）相关。人类可通过职业暴露（如接触柴油燃料、煤焦油）、饮食或吸烟等途径接触PAHs。尿液中单羟基化PAH代谢物（OH-PAHs）是评估PAH暴露的重要生物标志物。传统检测方法如气相色谱-质谱联用（GC-MS）需衍生化步骤，耗时且操作复杂；而高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）虽避免了衍生化，但样本需求量大（2–5 mL），限制了其在大规模流行病学研究中的应用。因此，本研究旨在开发一种高灵敏度、自动化、低样本量需求的在线固相萃取-同位素稀释-HPLC-MS/MS（online-SPE-HPLC-MS/MS）方法，用于尿液中9种OH-PAHs的定量分析。

研究流程与方法
1. 样本与试剂准备
- 研究对象：包括36名非吸烟者和36名吸烟者的尿液样本，以及美国国家标准与技术研究院（NIST）提供的标准参考物质（SRM 3672和3673）。
- 试剂与仪器：采用HPLC级溶剂，目标分析物及其同位素标记内标购自Cambridge Isotope Laboratories。样本处理通过PerkinElmer Staccato®全自动系统完成，包括酶解（β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶）、离心和在线SPE富集。

1. 自动化样本预处理

   • 酶解与提取：100 μL尿液与内标混合后，加入酶解缓冲液（pH 5.5），37℃孵育过夜。随后加入甲醇沉淀蛋白，离心后取上清液稀释，用于在线SPE。
     
   • 创新点：全自动96孔板平台显著提高通量，样本处理时间缩短至传统方法的1/10，且仅需100 μL尿液。
     

2. 在线SPE-HPLC-MS/MS分析

   • 色谱条件：采用Chromolith HighResolution RP-18色谱柱，以含0.1 mM氟化铵的甲醇/水梯度洗脱，27分钟内分离9种OH-PAHs（包括异构体2-OH-NAP/1-OH-NAP等）。
     
   • 质谱参数：电喷雾负离子模式（ESI−），多反应监测（MRM），碰撞能量优化至−26至−45 eV。例如，1-OH-NAP的离子对为143→115（内标149→121）。
     
   • 灵敏度与线性：检出限（LOD）为0.007–0.09 ng/mL，线性范围覆盖0.005–200 ng/mL（依分析物而异）。
     

3. 方法验证

   • 准确性：加标回收率94–113%，NIST标准物质回收率83–102%。
     
   • 精密度：日内和日间相对标准偏差（RSD）为3.2–16.7%。
     
   • 基质效应：通过同位素内标校正，基质因子为63–101%，表明尿液基质干扰可控。
     

主要结果
1. 方法性能：在线SPE-HPLC-MS/MS在灵敏度（LOD低至0.007 ng/mL）、准确性（回收率>94%）和精密度（RSD<16.7%）上均优于传统GC-MS和HPLC-MS/MS方法。
2. 实际样本分析：
- 非吸烟者中，1-OH-PYR（56%检出率）和4-OH-PHE（14%检出率）浓度较低；吸烟者中所有目标物检出率均≥97%，且几何平均浓度显著高于非吸烟者（最高相差12.4倍）。
- 吸烟者尿液中2-OH-NAP和1-OH-NAP浓度最高，提示萘（naphthalene）是烟草烟雾中PAHs的主要成分。

结论与价值
1. 科学价值：本研究首次将全自动在线SPE与HPLC-MS/MS结合，解决了传统方法样本量大、操作繁琐的瓶颈，为大规模PAH暴露研究提供了可靠工具。
2. 应用价值：该方法已成功应用于CDC的生物监测项目，支持国家健康调查（如NHANES）中PAH暴露评估。

研究亮点
1. 技术创新：
- 开发了基于96孔板的自动化样本前处理流程，通量提高10倍。
- 采用氟化铵添加剂增强负离子模式下的质谱灵敏度。
2. 实际意义：
- 仅需100 μL尿液即可完成9种OH-PAHs的精准定量，尤其适合儿童或样本量有限的研究。
- 通过吸烟与非吸烟者的对比数据，验证了方法在真实人群中的适用性。

其他发现
- 2-OH-PHE与3-OH-PHE因色谱共流出需合并报告（∑2,3-OH-PHE），提示未来需进一步优化分离条件。
- 长期稳定性测试表明，−70℃储存的样本中OH-PAHs至少1年内无显著降解。

此报告全面涵盖了研究的背景、方法、结果与意义，可作为相关领域研究者了解该技术的参考。