本研究由Yang Ji、Zhenggang Xu、Lei Tang等共同完成，通讯作者为Hao Lu、Chuanyong Zhang、Shikun Yang和Xuehao Wang。研究团队来自扬州大学医学院和南京医科大学第一附属医院肝胆中心（国家肝脏移植重点实验室）。该成果于2025年7月发表在《Cancer Letters》期刊（Volume 631, 217957）。

学术背景

代谢重编程是肿瘤发生发展的核心特征，其中以有氧糖酵解（Warburg效应）为代表的葡萄糖代谢异常尤为关键。肝细胞癌（HCC）作为高恶性消化道肿瘤，五年生存率不足20%，而糖酵解亢进与其增殖、转移及耐药密切相关。O-GlcNAc糖基化（O-linked N-acetylglucosaminylation）是一种动态蛋白质翻译后修饰，通过OGT（O-GlcNAc转移酶）和OGA（O-GlcNAc水解酶）的调控影响蛋白功能。Y-box结合蛋白1（YBX1）作为多功能转录因子，在多种癌症中发挥促癌作用，但其在HCC糖酵解调控中的机制尚未阐明。本研究旨在揭示YBX1通过O-GlcNAc糖基化介导的糖酵解-组蛋白乳酸化（histone lactylation）正反馈环路驱动HCC进展的分子机制。

研究流程与实验设计

1. YBX1在HCC糖酵解中的关键作用鉴定

• 数据挖掘：通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析GSE112271数据集（7例HCC样本，28,174个细胞），利用AUCell算法评估肿瘤微环境中糖酵解活性，发现其富集于肿瘤细胞。加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）筛选出与糖酵解相关的基因模块。
• 临床验证：TCGA-LIHC队列生存分析显示YBX1是独立预后风险因子（HR=1.82, p<0.001）。100例HCC组织芯片（TMA）免疫组化及Western blot证实YBX1在癌组织中高表达（p<0.01），且与肿瘤分期正相关（Table S1）。
• 功能实验：在HCC-LM3和Hep3B细胞中敲低YBX1后，靶向代谢组学（LC-MS）显示糖酵解中间产物（如6-磷酸葡萄糖、丙酮酸）和TCA循环代谢物（如柠檬酸）显著减少（p<0.01）。13C标记葡萄糖示踪实验证实代谢通量下降（M+3乳酸减少40%）。

2. YBX1的O-GlcNAc糖基化修饰机制

• 互作鉴定：免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱发现YBX1与OGT直接结合，免疫荧光显示二者在胞核/质共定位。截断体实验证实OGT的TPR结构域与YBX1的冷休克结构域（CSD, 52-129aa）相互作用。
• 位点解析：质谱鉴定出YBX1的6个潜在糖基化位点，其中T57位点突变（T57A）使O-GlcNAc修饰水平降低80%（图3n）。系统发育分析显示T57在哺乳动物中高度保守。
• 稳定性调控：OGT敲低加速YBX1降解（半衰期从12h缩短至6h），而OGA抑制剂Thiamet-G（TMG）处理可延长其半衰期至18h。机制上，O-GlcNAc修饰抑制E3泛素连接酶TRIM21介导的YBX1泛素化降解（泛素化水平降低60%）。

3. YBX1调控糖酵解的双重机制

• 转录调控：CUT&Tag分析显示YBX1结合PKM2和LDHA启动子区域（峰值富集度>5倍）。ChIP-qPCR验证YBX1在PKM2启动子区的富集（p<0.001）。敲低YBX1使PKM2 mRNA下降70%。
• mRNA稳定性调控：RIP-seq发现YBX1结合PKM2 mRNA的编码区（CDS），且NSUN2介导的m5C甲基化增强其结合（结合效率提高3倍）。放线菌素D实验显示YBX1敲低使PKM2 mRNA半衰期从8h缩短至3h。

4. 组蛋白乳酸化正反馈环路

• 乳酸化激活：YBX1敲低导致全局蛋白乳酸化（pan-Kla）和H3K18la水平下降50%。外源乳酸处理可上调YBX1表达2.5倍，而糖酵解抑制剂2-DG则抑制其表达。
• 分子机制：RNA-seq显示YBX1激活组蛋白乙酰转移酶p300的转录（表达量增加2.1倍）。p300过表达可逆转YBX1敲低导致的H3K18la降低（图8l）。
• 反馈调控：CUT&Tag证实H3K18la富集于YBX1启动子区，形成”YBX1-糖酵解-H3K18la-YBX1”正反馈环路。

主要结果与逻辑关联

1. 临床相关性：YBX1高表达与HCC不良预后显著相关（OS HR=2.3, p=0.004），为后续机制研究提供临床依据。
2. 代谢重编程：YBX1通过双重机制（转录激活PKM2/m5C依赖的mRNA稳定）促进糖酵解，解释其促癌表型（ECAR下降40%）。
3. 修饰调控网络：T57位O-GlcNAc糖基化通过抑制泛素化（降低60%）和促进AKT介导的S102磷酸化（增加3倍），驱动YBX1核转位。
4. 表观遗传调控：乳酸化修饰通过p300介导的H3K18la直接激活YBX1转录，形成自增强环路。

结论与价值

本研究首次揭示： 1. 分子机制创新：YBX1的O-GlcNAc糖基化通过”蛋白稳定-核转位-转录激活”三级调控网络驱动糖酵解。 2. 理论突破：发现组蛋白乳酸化对转录因子的正反馈调控，拓展了代谢-表观遗传互作理论。 3. 转化意义：YBX1-T57位点或OGT抑制剂可作为HCC治疗新靶点，H3K18la可能成为预后标志物。

研究亮点

1. 多组学整合：结合单细胞测序、空间转录组、CUT&Tag和代谢流分析，系统解析调控网络。
2. 修饰交叉对话：阐明O-GlcNAc糖基化与磷酸化协同调控YBX1功能的分子机制。
3. 环路发现：首次报道糖酵解-组蛋白乳酸化-YBX1的正反馈环路，为”代谢记忆”理论提供新证据。

其他价值

补充材料中包含NSUN2 C321A甲基转移酶失活突变体的功能验证数据，为m5C读写器研究提供工具。研究者开发的O-GlcNAc位点预测算法（基于质谱数据训练）已开源共享。