本文报道了一项关于裂殖酵母（*Schizosaccharomyces pombe*）中线粒体DNA（mtDNA）丢失后细胞存活机制的单篇原始研究。该研究由Katie Lin Amberg、Lyrica Hao、Susanne Cranz-Mileva和Mikel Zaratiegui共同完成，通讯作者为Mikel Zaratiegui，来自罗格斯大学分子生物学与生物化学系。论文发表于 *BMC Biology*，文章编号23:302，2025年在线发表，DOI为10.1186/s12915-025-02409-2。
线粒体是真核细胞中执行氧化磷酸化和蛋白质输入等关键功能的细胞器。部分酵母如酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）可在丢失线粒体基因组后继续存活，形成呼吸缺陷的“小菌落”（petite）突变体，该特性被称为“小菌落阳性”（petite-positivity）。然而，裂殖酵母天然表现为“小菌落阴性”（petite-negativity），即丢失mtDNA后细胞无法存活。此前研究表明，某些核基因突变可使裂殖酵母转变为小菌落阳性，其中第一个被发现的突变是*ptp1-1*，但其分子身份和机制长期未知。本研究旨在鉴定*ptp1-1*突变的基因身份，并阐明其使细胞在无mtDNA条件下存活的分子机制。
研究首先将携带*ptp1-1*突变的原始菌株php14与野生型菌株进行三轮回交，以获得遗传背景干净的分离子。通过四分子分析和基因组重测序，比较8个分离子的多态性，最终发现唯一一个在所有小菌落阳性分离子中存在、在所有小菌落阴性分离子中不存在的多态性，该突变位于*mts4*基因中，导致第636位亮氨酸突变为脯氨酸（mts4^L636P^）。
为确认该突变即为*ptp1-1*的致因突变，研究者利用CRISPR基因编辑技术进行了双向验证：将*ptp1-1*菌株中的mts4^L636P^突变回复为野生型序列，该菌株随之丧失小菌落阳性表型；同时在野生型菌株中引入mts4^L636P^突变，该菌株获得小菌落阳性表型。这确证了mts4^L636P^即为*ptp1-1*突变的分子基础。
*Mts4*蛋白是26S蛋白酶体19S调节亚基的核心组分，在酿酒酵母中称为Rpn1，人类中称为PSMD2。L636位于由11个螺旋-转角-螺旋重复序列形成的环形结构域中，突变为脯氨酸会破坏α螺旋的氢键网络，AlphaFold结构预测显示该突变在α螺旋中引入一个显著弯曲，可能影响蛋白质结构稳定性。
研究者通过三种实验评估了该突变对蛋白酶体功能的影响。首先，使用荧光底物Suc-LLVY-AMC测量细胞粗提物中蛋白酶体的糜蛋白酶样活性，结果显示mts4^L636P^突变体的MG132敏感肽酶活性比野生型降低30%~40%，且该降低在富营养培养基、含溴化乙锭（EtBr）培养基以及ρ^0^（无mtDNA）细胞中均一致表现。其次，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶内活性检测，发现突变体中26S蛋白酶体的信号明显减弱。第三，与已知的完全丧失功能的温度敏感等位基因*mts3-1*不同，mts4^L636P^突变体在氮饥饿诱导的G0期停滞中并未丧失活力，反而在长期无氮培养中表现出比野生型更高的存活率。此外，敲除线粒体自噬必需因子*atg43*并不影响mts4^L636P^的小菌落阳性表型，表明线粒体自噬不参与该突变体的ρ^0^存活机制。
为了探究mts4^L636P^突变实现小菌落阳性的机制，研究者将其与另一已知的小菌落阳性突变atp3^R282C^（F1-ATPase γ亚基突变）进行了系统比较。atp3^R282C^突变体在甘油呼吸培养基上生长极慢，表明其直接影响ATP合酶功能；而mts4^L636P^突变体在甘油培养基上生长正常，说明其不直接损害F1-ATPase活性。然而，两者的双突变体产生的ρ^0^细胞生长速度比任一单突变体ρ^0^细胞更快，提示两种突变通过不同机制促进ρ^0^存活。
为测试两种突变是否依赖于F1-ATPase的ATP水解活性来维持∆ψ，研究者敲除了编码F1催化β亚基的核基因*atp2*。结果显示，无论是mts4^L636P^还是atp3^R282C^背景，*atp2*敲除均导致小菌落阳性表型丧失。进一步利用*atp2-r4-3*低功能等位基因（保留约25% ATP水解活性）进行测试，发现atp3^R282C^在该背景下变为小菌落阴性，而mts4^L636P^仍保持小菌落阳性，仅ρ^0^菌落频率有所降低。
研究者利用对∆ψ敏感的荧光染料DiOC6直接测量了各突变体ρ^0^细胞的线粒体膜电位。结果显示，野生型ρ^+^细胞染色强烈；atp3^R282C^来源的ρ^0^细胞染色显著降低但仍可检出；而mts4^L636P^来源的ρ^0^细胞染色极弱，显著低于atp3^R282C^，线粒体形态也存在缺陷。双突变体ρ^0^细胞的染色强度接近野生型ρ^+^细胞但变异较大。这些结果表明，mts4^L636P^突变使ρ^0^细胞在∆ψ严重塌陷的情况下仍能存活，其机制独立于atp3^R282C^所依赖的∆ψ恢复途径。
为揭示mts4^L636P^突变在细胞应对线粒体功能障碍时的分子后果，研究者对野生型和突变体在含EtBr培养基中生长的细胞，以及分别来源于atp3^R282C^和mts4^L636P^的ρ^0^细胞进行了液相色谱-质谱（LC/MS）全蛋白质组分析。两组比较共检测到超过3400个蛋白的肽段。在EtBr处理条件下的比较未显示显著的基因本体（GO）富集，但*mts4*及其19S亚基组装伙伴*rpt1*和*rpt2*的丰度在突变体中均降低，表明该突变影响了蛋白酶体组装模块的稳定性。
在ρ^0^细胞间的比较中，atp3^R282C^来源的细胞显示呼吸作用和ATP代谢相关线粒体蛋白丰度升高，与其通过∆ψ恢复存活的机制一致；而mts4^L636P^来源的细胞则富集了参与细胞应激响应的蛋白。通过对两组比较的交叉分析，研究者鉴定出在两种条件下均一致上调的11个因子，包括线粒体伴侣蛋白Hsp78、胞质伴侣蛋白Hsp104和Ssa1，以及多个氧化应激解毒相关因子。这些上调因子与未折叠蛋白响应（UPR）和Pap1转录因子调控的氧化应激基因群显著关联，而Pap1本身受蛋白酶体直接调控其稳定性。
代谢组分析显示，在EtBr培养基中生长的mts4^L636P^突变体还原型谷胱甘肽（GSH）水平降低，氧化型谷胱甘肽（GSSG）水平升高，表明其氧化应激响应发生了改变。进一步的功能实验表明，在EtBr处理中添加活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）对野生型和突变体产生相反效果：NAC使野生型细胞在EtBr处理后存活增加，却剂量依赖性地降低了mts4^L636P^突变体的ρ^0^菌落形成频率和生长。这说明突变体中小菌落阳性的实现部分依赖于其改变的氧化应激响应状态。
本研究首次明确了裂殖酵母经典小菌落阳性突变*ptp1-1*的分子身份为26S蛋白酶体19S调节亚基核心组分*mts4*基因的功能部分缺失突变（mts4^L636P^）。研究证明，该突变通过一种独立于线粒体膜电位恢复的机制实现ρ^0^细胞的存活，这与已知的通过F1-ATPase反转活性恢复∆ψ的atp3^R282C^突变机制截然不同。mts4^L636P^突变导致的蛋白酶体功能部分下降，引发了胞质和线粒体伴侣蛋白以及氧化应激解毒因子的上调，这些因素可能在ρ^0^细胞的应激耐受中发挥关键作用。该发现将蛋白酶体功能障碍与线粒体功能维持联系起来，与在其他生物中观察到的部分蛋白酶体活性降低对线粒体功能有益的现象相呼应，为理解线粒体生物学及其在衰老过程中的作用提供了新的视角。此外，由于蛋白酶体几乎参与所有细胞过程，目前尚难以确定是小菌落阳性由特定蛋白酶体底物的累积还是蛋白酶体功能普遍丧失引发的应激反应所介导，该研究为后续探索这一普遍现象的分子机制奠定了基础。