本研究由Neeti Puri、Jie Lai-Zhang、Scott Meier和David M. Mueller完成，通讯作者David M. Mueller就职于Rosalind Franklin University of Medicine and Science（罗莎琳德富兰克林医科大学）芝加哥医学院生物化学与分子生物学系。论文发表于*The Journal of Biological Chemistry*（《生物化学杂志》）2005年6月10日第280卷第23期，页码22418–22424，数字对象标识符（doi）为10.1074/jbc.M411113200。

该研究属于线粒体生物能学与膜蛋白复合物异源表达领域。线粒体F1F0-ATP合酶（F1F0-ATP synthase）是氧化磷酸化的关键酶，负责利用质子跨膜驱动力催化ADP与无机磷合成ATP。其水溶性部分F1-ATPase（F1-ATPase）由α3β3γδε五种亚基组成，分子量约370 kDa，含有三个催化位点，能够单独催化ATP水解。F0为膜内质子通道，F1与F0之间通过中央柄和外周柄连接。由于哺乳动物F1-ATPase的大量制备和突变分析较为困难，而酵母遗传操作体系成熟，因此本研究尝试在酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）中表达牛（bovine）F1-ATPase，以期为哺乳动物ATP合酶的生化、结构及功能研究提供平台。研究的直接科学问题是：牛F1-ATPase能否在酵母中组装为功能性酶复合物；如果初始不能互补酵母缺失突变体，是否可通过实验室进化获得功能；以及牛F1在酵母中表达后的酶学性质如何。需要指出的是，F1-ATPase各亚基在牛与酵母之间的保守程度差异较大，α和β亚基同源性较高，γ、δ、ε亚基同源性较低，这为异源复合物的正确组装带来潜在障碍。

研究者在实验流程上首先构建了酵母F1五亚基缺失突变体。以W303-1A为亲本菌株，依次敲除编码α、β、γ、δ、ε亚基的ATP1、ATP2、ATP3、ATP16、ATP15基因。敲除顺序为先ATP2，再ATP1，而后ATP3、ATP15、ATP16，其原因是如果在未缺失ATP1或ATP2的情况下直接缺失ATP3、ATP15或ATP16，会导致线粒体DNA丢失，使细胞丧失呼吸能力。基因敲除采用同源重组方法，以含有loxP-kanMX-loxP模块的PCR产物进行定向破坏，再通过Cre重组酶切除kanMX抗性基因，仅留下单个loxP位点，获得无标记的缺失菌株。最终得到五基因缺失菌株ΔαΔβΔγΔδΔεgs和四基因缺失菌株ΔαΔβΔγΔεgs。随后，将牛α、β、γ、δ、ε亚基cDNA分别与酵母ATP1或ATP2启动子、线粒体导肽及终止子融合，构建嵌合表达质粒。其中α亚基嵌合基因构建在酵母ATP1基因框架中，β、γ、δ、ε亚基构建在酵母ATP2基因框架中。由于酵母可利用的筛选标记有限，δ和ε亚基被共同构建在同一质粒pRS314上。这些质粒分别转化入五缺失菌株或四缺失菌株，用营养缺陷型标记维持质粒。对于五缺失菌株，还引入了Δpep4突变以减少液泡主要蛋白酶Pep4p对表达产物的降解。实验结果显示，初始转化牛F1的菌株不能在以甘油为唯一碳源的非发酵培养基YPG上生长，表明牛F1与酵母F0及柄部蛋白之间不能有效偶联。

为了恢复功能，研究者进一步实施实验室进化。将表达牛F1的酵母细胞以约5×10⁷个细胞涂布于YPG平板，30 ℃培养后选取能够生长的大菌落，记为第一代；再在液体YPG中扩增后涂板，选大菌落记为第二代；重复一次获得第三代。结果显示，随着进化代数增加，菌株在YPG上的生长能力逐步改善。这一现象既出现在含酵母δ亚基的嵌合F1菌株中，也出现在全牛F1菌株中。为判断进化获得的突变是否位于牛F1亚基质粒编码区，研究者用5-氟乳清酸（5FOA）反选择法逐一去除质粒后再重新转入原始牛亚基表达质粒，获得菌株bf1-g3cp。该菌株仍能在YPG上生长，且生长速率与进化亲本bf1-g3相近，说明质粒编码区的突变并非功能获得所必需。随后对五个牛亚基编码区进行DNA测序，未发现改变氨基酸序列的突变。因此，导致嵌合ATP合酶功能恢复的突变应位于酵母细胞核基因组或线粒体基因组，推测可能涉及线粒体编码的F0亚基或参与ATP合酶组装与表达的调控基因。

在生化验证方面，研究者从进化菌株yΔbf1-g3和bf1-g3中分离线粒体，测定ATPase活性。结果显示，与野生型酵母线粒体ATPase活性约1.1 units/mg相比，表达牛F1的菌株线粒体ATPase活性明显较低，bf1-g3约为0.15 units/mg，yΔbf1-g3约为0.33 units/mg。用氯仿从线粒体膜上释放F1后，牛F1的活性也明显低于野生型酵母F1，其中bf1-g3氯仿提取物活性为2.4 units/mg，yΔbf1-g3为4.1 units/mg，而野生型对照为13.0 units/mg。对寡霉素的敏感性分析显示，牛F1在酵母线粒体中对寡霉素的敏感程度低于酵母F1，表明牛F1与酵母F0的结合不如同源酶紧密。但牛F1活性对efrapeptin敏感，说明所测活性确实来源于线粒体F1-ATPase。Western blot进一步证实牛α和β亚基在线粒体及氯仿释放组分中均有表达，且抗牛亚基抗体与酵母亚基反应较弱，支持所表达复合物的异源属性。研究者还从YPG培养基培养的bf1-g3菌株中部分纯化了牛F1-ATPase。纯化流程包括线粒体分离、氯仿释放、阴离子交换层析和Superose 6凝胶过滤层析。最终比活性为47 units/mg，约为牛心线粒体来源F1-ATPase比活性的一半。SDS-PAGE和Western blot显示α亚基发生部分降解，酶纯度约50%，因此比活性降低主要来自纯度和蛋白酶降解，而非牛F1催化能力的内在缺陷。

从研究结论看，牛F1-ATPase的全部五种亚基可在酵母中表达并最终组装为具有催化活性的酶复合物，尽管初始状态下牛F1不能与酵母F0及柄部蛋白有效偶联。通过实验室进化，细胞内其他基因发生突变后可以恢复嵌合ATP合酶的功能，而牛亚基本身无需发生突变。这一结果说明哺乳动物F1-ATPase与酵母ATP合酶组装机器之间存在一定程度的保守性，但异源亚基间的界面相容性仍是功能偶联的限制因素。同时，酵母δ亚基能够替代牛δ亚基参与牛F1复合物，说明δ亚基在功能上具有一定可替换性，尽管此前研究表明牛δ亚基不能替代酵母δ亚基。该工作为利用酵母系统表达和纯化哺乳动物F1-ATPase提供了实验依据，也为后续利用酵母进行哺乳动物F1或F1F0-ATP合酶的突变分析、结构研究以及等位基因变异功能验证提供了平台。

本文的重要发现与亮点主要体现在三个方面。第一，首次报道了牛F1-ATPase五亚基在酵母中的共表达和功能恢复。第二，发现功能获得性突变不需要发生在牛F1编码区，而可能发生在酵母自身基因组中，为理解线粒体ATP合酶亚基间协同进化提供了新视角。第三，建立了“初始异源表达—实验室进化—功能筛选—回补验证”的研究策略，可推广至其他多亚基膜蛋白复合物的异源功能重建研究。此外，该研究还提示，如果未来要进一步提高哺乳动物F1在酵母中的表达量和稳定性，可能需要将哺乳动物柄部蛋白和F0亚基一并共表达，尤其需要解决线粒体基因组编码亚基的异源导入问题。