本研究由Ying Zhang、Enlai Wang、Shiyang Li、Yufan Yao、Quanlin Shao、Yanfang Wang、Yingjiao He、Mingqi Liu、Xiang Jin、Zhen Gu及Ran Mo等人完成，主要通讯作者为Zhen Gu（浙江大学）和Ran Mo（中国药科大学）。该论文发表于 *Nature Nanotechnology*，于2024年4月17日收稿，2026年5月6日接收并在线发表，论文DOI为https://doi.org/10.1038/s41565-026-02194-1。
研究背景
癌症干细胞样细胞（cancer stem-like cells, CSCs）是肿瘤内部异质性的主要来源之一，具有高度的治疗抵抗性，可导致肿瘤对免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）应答不佳。CSCs能够通过下调抗原加工与递呈分子、高表达抑制性免疫检查点分子、分泌免疫抑制性细胞因子等方式逃避免疫识别与清除，并促进免疫抑制性肿瘤微环境（tumour microenvironment, TME）的形成。传统化疗药物如阿霉素（doxorubicin, DOX）虽然能诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD），从而增强ICIs的疗效，但CSCs对化疗高度耐受，DOX难以有效激活其ICD。此外，化疗还可能富集CSC群体，进一步加剧肿瘤的干性和免疫抑制。全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA）是一种分化诱导药物，可促使CSCs分化为非致瘤性子代细胞，降低其干性相关的化疗抵抗性。因此，将ATRA与DOX联用并实现时序性释放，有望先通过ATRA敏化CSCs，再由DOX诱导其ICD，从而增强抗肿瘤免疫应答。
研究流程与实验设计
研究首先构建了CSC富集的肿瘤球细胞（tumoursphere cells, TCs）模型。将小鼠黑色素瘤B16F10贴壁细胞（adherent cells, ACs）在无血清悬浮条件下培养，得到的TCs具有显著增强的自我更新能力，并高表达ALDH、ABCB5等CSC标志物。通过将不同比例的ACs与TCs混合接种建立小鼠黑色素瘤模型，发现TCs比例越高，肿瘤中CD8+ T细胞浸润越少，且Nanog和ABCB5表达越高，说明高干性肿瘤具有更强的免疫抑制微环境。体外实验显示，TCs较ACs对激活脾细胞的免疫杀伤更具抵抗力。与ACs相比，TCs对DOX的耐受性更强，单独DOX处理未能显著增加TCs表面钙网蛋白（calreticulin, CRT）暴露；而ATRA与DOX联合处理，尤其是ATRA预处理后再与DOX共同处理，可显著提高TCs的CRT暴露、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）释放和ATP分泌，表明ATRA通过诱导CSCs分化增强了DOX触发的ICD。转录组和蛋白质组分析进一步揭示，ATRA处理可抑制细胞周期并促进分化，同时上调MHC-I抗原加工递呈相关蛋白。
在药物递送系统的构建与优化方面，研究者制备了由单油酸甘油酯（glycerol monooleate, GMO）和磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine, PC）组成的溶致液晶脂质凝胶（lipogel）。该lipogel具有反六角相结构，疏水性药物ATRA负载于脂质部分，亲水性药物DOX盐酸盐包封于水通道中。为调控药物释放动力学，研究者对配方进行了筛选，发现加入10 wt%肉豆蔻酸异丙酯（isopropyl myristate, IPM）后，形成的ATRA/DOX/dgel可实现差异性释放：ATRA释放显著快于DOX。未加IPM的ATRA/DOX/cgel则呈现同步释放。小角X射线散射（SAXS）证实lipogel保持反六角相结构，IPM比例增加使水通道孔径减小，从而降低DOX释放速率而几乎不影响ATRA。热重分析（TG）显示IPM增加可降低lipogel含水量。流变学测试表明lipogel具有剪切变稀和快速恢复的特性。体外实验证明，与ATRA/DOX/cgel相比，ATRA/DOX/dgel处理的TCs及侧群（side population, SP）细胞具有更高的CRT暴露、HMGB1释放和ATP分泌。体内药物释放实验显示，lipogel瘤内注射后可实现药物的持续释放，并显著提高瘤内药物浓度同时降低系统暴露。
在体内免疫激活实验中，研究者利用B16F10 TC成瘤小鼠模型评估了lipogel对免疫微环境的影响。DOX/dgel在TC成瘤模型中对CRT表达的诱导明显弱于AC成瘤模型，说明高干性肿瘤对DOX存在抵抗。ATRA/DOX/dgel处理可显著提高TC成瘤中CRT表达并减少ABCB5+细胞群。流式细胞术分析显示，ATRA/DOX/dgel处理可明显增加肿瘤内CD45+白细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、活化CD8+（CD69+）T细胞和CD8+效应T细胞（IFNγ+）的比例，同时增加活化树突状细胞（DCs）并减少髓源性抑制细胞（MDSCs）和M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。在引流淋巴结中，活化DCs比例也显著升高；血清IFNγ和TNF-α水平同步升高。而在AC成瘤模型中，ATRA/DOX/dgel与ATRA/DOX/cgel或DOX/dgel之间的免疫细胞浸润差异不明显，表明差异性释放策略对高干性肿瘤尤为重要。
在抗肿瘤疗效评价中，ATRA/DOX/dgel在B16F10 TC成瘤模型中的抑瘤率约76%，显著优于ATRA/DOX/cgel、DOX/dgel、ATRA/dgel及游离药物混合液。在SP细胞成瘤模型中，ATRA/DOX/dgel仍保持约69%的抑瘤率，而ATRA/DOX/cgel仅约42%，进一步说明差异性释放对高干性肿瘤的关键作用。CD8+或CD4+ T细胞耗竭实验证实，适应性免疫在ATRA/DOX/dgel介导的肿瘤抑制中发挥重要作用。在免疫缺陷裸鼠模型中，ATRA/DOX/dgel的抑瘤效果与ATRA/DOX/cgel及DOX/dgel无显著差异，且总体抑瘤率低于免疫健全小鼠，说明免疫应答是该疗法的主要机制之一。
在术后复发模型中，手术切除原发肿瘤后将lipogel植入术腔。ATRA/DOX/dgel可显著延缓肿瘤复发，联合全身给予抗PD-1抗体（aPD1）后抑制效果进一步增强，复发肿瘤抑制率达93%。在4T1三阴性乳腺癌TC成瘤模型中，ATRA/DOX/dgel同样提高了肿瘤内CRT表达和T细胞浸润，与aPD1联用后抑瘤率最高。在MMTV-PyMT转基因自发性乳腺癌模型中，ATRA/DOX/dgel联合aPD1的抑瘤率约63%，并显著增加CD8+和CD8+效应T细胞浸润。
在系统性免疫应答和免疫记忆研究中，利用双侧肿瘤模型发现，ATRA/DOX/dgel联合aPD1不仅抑制了治疗侧原发肿瘤的复发，也显著抑制了未治疗侧远端肿瘤的生长，并增加两侧肿瘤中CD8+和CD4+ T细胞浸润。脾脏中效应记忆T细胞（Tem，CD3+CD8+CD44+CD62L−）比例在联合治疗后显著升高。再次静脉注射B16F10-luc TCs进行攻击后，联合治疗组小鼠肺部几乎未检测到肿瘤转移灶，而对照组和单药组均有明显转移。在免疫缺陷裸鼠中，该抗转移作用显著减弱，证明该效应依赖适应性免疫系统。
研究结论与意义
该研究开发了一种由FDA批准的辅料（GMO、PC和IPM）组成的免疫刺激性lipogel，可在局部实现ATRA和DOX的时序性差异性释放。ATRA先快速释放诱导CSCs分化，降低化疗抵抗；DOX随后持续释放诱导ICD，促进肿瘤免疫原性。该策略可有效克服高干性肿瘤的免疫抑制微环境，增强ICIs的治疗效果。在多种CSC富集的小鼠肿瘤模型中，ATRA/DOX/dgel局部植入联合aPD1全身给药不仅抑制了原发肿瘤生长和术后复发，还诱导了系统性抗肿瘤免疫应答和T细胞记忆，抑制了远端肿瘤和转移。该研究为高干性实体瘤的局部免疫治疗提供了新思路和可临床转化的递送平台。主要亮点包括：利用溶致液晶lipogel实现亲脂性和亲水性药物的差异性释放；针对CSC干性相关的免疫抵抗进行时序性联合治疗；在多种高干性肿瘤模型中验证了联合ICIs的协同疗效。需指出的是，研究观察期内未发现明显的血液学或器官毒性，但长期安全性仍需进一步评估。