关于将致病性T细胞转化为功能稳定的Treg细胞用于寻常型天疱疮抗原特异性免疫抑制的研究报告

一、 研究团队与发表信息

本项研究由日本庆应义塾大学医学院皮肤科的Miho Mukai、Hayato Takahashi（通讯作者之一）、Masayuki Amagai（通讯作者之一）等领衔，联合大阪大学实验免疫学系、理化研究所综合医学科学中心皮肤稳态实验室等多个机构的研究人员共同完成。研究成果以题为《Conversion of pathogenic T cells into functionally stabilized Treg cells for antigen-specific immunosuppression in pemphigus vulgaris》的研究论文形式，于2025年10月22日发表在《Science Translational Medicine》 期刊上（卷17，文章号 eadq9913）。

二、 学术背景与研究目的

本研究属于免疫学与自身免疫性疾病治疗领域，聚焦于寻常型天疱疮（Pemphigus vulgaris, PV）。PV是一种由抗桥粒芯糖蛋白3（Desmoglein 3， Dsg3）自身抗体介导的、危及生命的皮肤黏膜自身免疫性大疱病。当前的治疗主要依赖非特异性的全身免疫抑制，存在感染、代谢紊乱等严重副作用。因此，开发能够精确靶向致病性自身免疫反应、而不影响整体免疫功能的疗法是迫切需求。

调节性T细胞（Regulatory T cells, Treg cells）是维持免疫耐受的关键细胞亚群，其核心转录因子是Foxp3。基于Treg细胞的疗法被认为是治疗自身免疫病的潜力策略。然而，临床应用面临两大挑战：1) 抗原特异性：如何获得大量针对特定自身抗原（如Dsg3）的Treg细胞；2) 功能稳定性：体外诱导的Treg细胞（induced Treg， iTreg）通常缺乏Treg细胞特有的表观遗传修饰（如Foxp3基因CNS2区域的去甲基化），导致其Foxp3表达不稳定，在体内易失去抑制功能，甚至可能转化为致病性效应T细胞。

此前研究已建立PV小鼠模型，并证实Dsg3特异性的致病性CD4+ 常规T细胞（Tconv）在疾病发生中起核心作用，而Treg细胞对控制Dsg3特异性自身免疫至关重要。基于此，本研究旨在开发一种创新策略：将PV患者或模型动物中存在的、针对Dsg3的致病性自身反应性Tconv细胞，在体外高效转化为功能稳定、抗原特异性保留的Treg细胞（命名为稳定功能性诱导Treg细胞， s/f-iTreg），并将其用于PV的抗原特异性免疫抑制治疗。研究目标是在动物模型中验证其疗效，并探索从PV患者外周血中生成此类细胞的可行性。

三、 详细研究流程与方法

本研究流程系统而复杂，主要包含体外细胞转化、动物模型验证和人类细胞验证三大阶段。

第一阶段：Dsg3特异性s/f-iTreg细胞的体外诱导与表征 1. 细胞来源与处理：研究使用两种小鼠：野生型（WT）和携带Dsg3特异性T细胞受体（TCR）的转基因小鼠（Dsg3H1）。从这些小鼠的皮肤引流淋巴结（sLNs）中分选出初始（naïve）CD4+ Tconv细胞作为原料。 2. s/f-iTreg细胞诱导方案：采用了一种优化的多步骤诱导方案。该方案的核心在于结合了药理学诱导Foxp3和共刺激信号依赖的表观遗传重塑。 * Foxp3诱导：使用CDK8/19抑制剂（AS2863619）联合TGF-β，强力诱导Foxp3表达，即使在效应/记忆T细胞中也能有效诱导。 * 表观遗传稳定化：在诱导过程中，通过去除CD28共刺激信号（不使用抗CD28激动抗体或阻断CD80/CD86），安装Treg细胞特异性的表观遗传改变，特别是Foxp3基因CNS2区域的DNA去甲基化。 * 优化方案：方案包括两次为期3天的TCR刺激（使用板结合的抗CD3抗体）和诱导培养，中间穿插一次为期4天的仅含IL-2的静息培养。此外，还添加了全反式维甲酸（ATRA）以增强Foxp3表达并抑制促炎因子，添加抗坏血酸（作为TET去甲基化酶的辅因子）以增强去甲基化，并添加IL-27以促进抗炎因子IL-10的产生。最终产物被定义为s/f-iTreg细胞。作为对照，也制备了传统的iTreg细胞（c-iTreg，使用抗CD28抗体进行刺激）。 3. 体外功能与表型分析： * 表型验证：通过流式细胞术检测Foxp3、CTLA-4、LAG3、CD73等Treg标志物的表达。 * 表观遗传分析：采用亚硫酸氢盐测序法分析Foxp3 CNS2区域的甲基化状态，评估功能稳定性。 * 转录组分析：通过RNA测序（RNA-seq）比较s/f-iTreg、c-iTreg和天然Treg（nTreg）的基因表达谱。 * 体外抑制实验：评估s/f-iTreg细胞的抗原特异性抑制功能。将CFSE标记的Dsg3H1 Tconv细胞（应答细胞）与不同来源的Treg细胞（抑制细胞）及抗原提呈细胞共培养，在非特异性（抗CD3）或特异性（Dsg3肽段）刺激下，通过流式细胞术检测应答细胞的增殖抑制情况。同时，使用无关抗原（卵清蛋白， OVA）特异性的OT-II T细胞系统进行反向验证。

第二阶段：s/f-iTreg细胞在小鼠自身免疫模型中的疗效评估 研究使用了两种不同的PV相关小鼠模型来全面评估s/f-iTreg细胞的治疗潜力。 1. T细胞介导的自身免疫性皮炎模型： * 模型建立：将Dsg3H1小鼠的初始CD4+ Tconv细胞与WT小鼠的B细胞共同过继转移给Rag2-/-小鼠，诱导产生以界面性皮炎为特征的皮肤炎症（不产生自身抗体）。 * 治疗与评估：在疾病诱导后第7天，静脉注射不同剂量的Dsg3H1 s/f-iTreg细胞进行治疗。评估指标包括：临床皮炎评分、体重变化、皮肤组织病理学分析（H&E染色）、以及通过流式细胞术分析sLNs和皮肤中分泌IFN-γ和IL-17A的致病性T细胞数量。 * 机制探索：为了追踪Treg细胞在体内的命运，使用了Foxp3-hCD2报告基因小鼠来源的Treg细胞。过继转移后，分析这些细胞在sLNs、肠系膜淋巴结和脾脏中的定位、Foxp3表达的稳定性、增殖情况（Ki-67表达）以及抑制分子（如CTLA-4、LAG3、IL-10）的表达。通过RNA-seq进一步分析其转录谱。 2. 经典PV模型（抗体介导）： * 模型建立：将用重组Dsg3蛋白免疫过的Dsg3-/-小鼠的脾脏和淋巴结细胞（包含活化的Dsg3特异性T和B细胞）过继转移给Rag2-/-小鼠，诱导产生高滴度抗Dsg3 IgG抗体和典型的天疱疮临床及病理表现。 * 预防与治疗实验： * 预防性给药：在过继转移致病细胞的同时，共同注射Dsg3H1 s/f-iTreg细胞。 * 治疗性给药：在过继转移致病细胞后第7天或第14天（已出现症状），再注射Dsg3-/-背景的Dsg3H1 s/f-iTreg细胞。 * 评估指标：定期监测血清抗Dsg3 IgG抗体滴度（ELISA）、临床评分、体重。终点时分析皮肤和黏膜组织的IgG沉积（免疫荧光）和病理学变化（H&E染色）。通过酶联免疫斑点法（ELISpot）检测脾脏和sLNs中分泌抗Dsg3 IgG的B细胞频率。检测血清细胞因子水平。 * 机制探究：为了研究s/f-iTreg细胞如何抑制自身抗体产生，重点关注了其对滤泡辅助性T细胞（Tfh细胞）分化的影响。通过过继转移实验，分析s/f-iTreg细胞对Dsg3特异性Tfh细胞分化的抑制作用。并利用CRISPR-Cas9技术敲除s/f-iTreg细胞中的CTLA-4基因，验证CTLA-4在其抑制功能中的关键作用。 3. 多克隆s/f-iTreg细胞的生成与评估：从免疫了重组Dsg3的Dsg3-/-小鼠中分选效应/记忆CD4+ T细胞（预计富集了Dsg3反应性细胞），将其转化为多克隆s/f-iTreg细胞，并评估其在PV模型中的安全性（是否加剧疾病）和表型（细胞因子分泌谱）。

第三阶段：从PV患者外周血生成s/f-iTreg细胞 1. 细胞来源：从PV患者和健康对照者的外周血单核细胞（PBMCs）中分选CD4+ Tconv细胞。 2. 诱导方案优化：应用类似小鼠的诱导方案。发现患者来源的s/f-iTreg细胞Foxp3 CNS2去甲基化率略低于健康对照。通过添加地塞米松和环磷酸腺苷（cAMP）进行优化，显著提高了患者来源s/f-iTreg细胞中Foxp3和CTLA-4的表达，并降低了促炎因子TNF-α等的产生。 3. 功能与稳定性测试： * 通过RNA-seq和PCA分析比较优化前后细胞的转录组差异。 * 将诱导的s/f-iTreg细胞在不同细胞因子条件下（模拟Th0, Th1, Th2, Th17环境）进行再刺激，检测其Foxp3和CTLA-4表达的稳定性。 * 进行体外抑制实验：将患者来源的s/f-iTreg细胞与自体CFSE标记的PBMCs共培养，在抗CD3刺激下，通过流式细胞术评估其对自体CD4+ T细胞增殖的抑制能力。

四、 主要研究结果

1. 成功诱导出功能稳定、抗原特异性的小鼠s/f-iTreg细胞：

   • 从Dsg3H1小鼠Tconv细胞高效诱导出的s/f-iTreg细胞，其Foxp3阳性率（~90%）和Foxp3 CNS2去甲基化率（~90%）远高于c-iTreg细胞（~20%和~8%），与nTreg细胞相似，表明其表型和表观遗传稳定性。
   • RNA-seq聚类分析显示，Dsg3H1 s/f-iTreg细胞的基因表达谱与nTreg细胞更相似，高表达Foxp3、IL2RA、CTLA4、ENTPD1（CD39）、NT5E（CD73）、LAG3、IL10等Treg特征基因。
   • 体外抑制实验证明其抗原特异性：在Dsg3肽段刺激下，只有Dsg3H1 s/f-iTreg细胞能强烈抑制Dsg3H1 Tconv细胞的增殖，而WT s/f-iTreg或OVA特异性s/f-iTreg细胞则不能。反之，在OVA肽段刺激下，只有OVA特异性s/f-iTreg细胞能抑制OT-II T细胞的增殖。在非特异性抗CD3刺激下，所有s/f-iTreg细胞均表现出强大的非特异性抑制能力。这明确了其功能依赖于抗原特异性识别。

2. Dsg3特异性s/f-iTreg细胞有效抑制T细胞介导的自身免疫性皮炎：

   • 在皮炎模型中，过继转移Dsg3H1 s/f-iTreg细胞能剂量依赖性地改善临床症状、减轻体重下降、减少皮肤淋巴细胞浸润。
   • 与WT s/f-iTreg细胞相比，Dsg3特异性s/f-iTreg细胞的治疗效果显著更优，证明了抗原特异性带来的治疗优势。
   • 机制上，转移的Dsg3特异性s/f-iTreg细胞在皮肤引流淋巴结（sLNs）中特异性扩增，并维持高水平的Foxp3表达和Treg特征基因（如CTLA-4, LAG3, IL-10）表达。它们显著减少了sLNs和皮肤中分泌IFN-γ和IL-17A的Dsg3特异性致病性T细胞数量。

3. Dsg3特异性s/f-iTreg细胞抑制自身抗体产生并缓解PV疾病进展：

   • 在PV模型中，无论是预防性还是治疗性（疾病已启动）给药，Dsg3特异性s/f-iTreg细胞都能显著降低血清抗Dsg3 IgG抗体滴度，改善临床症状，减少皮肤IgG沉积和棘层松解性水疱的形成。
   • 这种抑制是抗原特异性且不引起全身免疫抑制的：s/f-iTreg细胞选择性减少了分泌抗Dsg3 IgG的B细胞数量，但不影响总B细胞数量。
   • 机制探究表明，s/f-iTreg细胞通过其高表达的CTLA-4，有效抑制了Dsg3特异性Tfh细胞的分化，从而阻断了帮助B细胞产生致病性抗体的关键环节。CRISPR敲除CTLA-4后，s/f-iTreg细胞的抑制能力显著下降。

4. 可从PV患者外周血成功生成具有抑制功能的人源s/f-iTreg细胞：

   • 成功从PV患者PBMCs中诱导出s/f-iTreg细胞。尽管其初始Foxp3 CNS2去甲基化率略低于健康对照，但通过添加地塞米松和cAMP进行优化后，其Foxp3和CTLA-4表达显著提升，促炎因子TNF-α分泌降低，转录组特征更接近稳定功能状态。
   • 优化后的患者来源s/f-iTreg细胞在多种细胞因子环境中能维持Foxp3和CTLA-4表达，并在体外能有效抑制自体CD4+ T细胞的增殖，证明了其功能稳定性和治疗潜力。

五、 研究结论与价值

本研究成功地开发了一种将致病性自身反应性Tconv细胞转化为功能稳定、抗原特异性保留的s/f-iTreg细胞的策略，并在PV的临床前模型中验证了其治疗效力。核心结论是：利用患者自身的致病性T细胞，通过药理学和免疫学方法进行“重编程”，可以制造出能够精准靶向并抑制特定自身免疫反应的治疗性细胞，而不引起广泛的免疫抑制。

其科学价值在于： 1. 概念验证：首次证明在一种明确的自身免疫病（PV）中，抗原特异性的致病性T细胞可以被直接转化为具有治疗功能的抗原特异性Treg细胞。 2. 机制阐明：详细阐明了s/f-iTreg细胞发挥治疗作用的多个机制，包括在抗原富集部位（sLNs）的克隆扩增、通过CTLA-4等分子抑制Tfh细胞分化和自身抗体产生、以及其稳定的表观遗传和转录特征。 3. 方法学创新：建立了一套结合CDK8/19抑制剂诱导Foxp3和去除CD28信号安装表观遗传印记的标准化诱导方案，并进一步通过添加地塞米松/cAMP等优化人源细胞的制备。

其应用价值与前景： 1. 个性化细胞治疗新路径：为PV及其他已知靶抗原的自身免疫病（如1型糖尿病、多发性硬化症等）提供了一种全新的、高度特异性的“个性化”细胞治疗策略。 2. 安全性潜力：由于疗法具有抗原特异性，且细胞来源于患者自身，理论上可最大程度降低全身免疫抑制和移植物抗宿主病等风险。 3. 临床转化桥梁：研究不仅在小鼠模型中取得突破，还初步证明了从患者外周血制备功能性s/f-iTreg细胞的可行性，为开展首次人体临床试验奠定了基础。

六、 研究亮点

1. 靶点创新：直接以疾病相关的致病性自身反应性T细胞作为治疗细胞的来源，实现了“变害为宝”的转化。
2. 技术突破：成功解决了iTreg细胞功能不稳定这一长期难题，通过表观遗传重塑获得了具有nTreg样稳定性的s/f-iTreg细胞。
3. 疗效卓越且精准：在两种不同的疾病模型（细胞介导和抗体介导）中均显示出强大疗效，并明确证明了其抗原特异性和局部作用（在sLNs扩增）的特点，避免了系统性免疫抑制。
4. 转化医学紧密结合：从动物模型到人源细胞制备的完整链条研究，每一步都着眼于解决临床应用的潜在障碍（如细胞稳定性、患者细胞可行性），体现了强大的转化潜力。
5. 机制深入：不仅证明了疗效，还深入揭示了s/f-iTreg细胞在体内存活、扩增、定位以及通过CTLA-4抑制Tfh/B细胞轴的具体分子机制。

七、 其他有价值的内容

研究在讨论部分也坦诚指出了当前研究的局限性及未来方向：例如，s/f-iTreg细胞疗法在人体中需要多少次输注、长期安全性如何、与患者现有免疫抑制剂（如糖皮质激素）的相互作用等，仍需在临床试验中验证。同时，研究也对比了其他Treg疗法（如nTreg细胞、CAR-Treg细胞）的优劣，指出s/f-iTreg策略在细胞来源的丰富性、避免基因编辑风险等方面的优势。最后，作者提出未来可通过利用疾病部位浸润的T细胞或使用HLA四聚体进一步富集抗原特异性细胞，以优化该策略并拓展至其他自身免疫病。