单细胞VDJ测序技术在正常与恶性B/T细胞研究中的应用与方法学进展

作者与发表信息
本文由Ann-Kathrin Schnormeier与Bettina Budeus共同撰写，收录于Ralf Küppers主编的《Lymphoma: Methods and Protocols》第14章（Methods in Molecular Biology系列，卷2865），预计于2025年由Springer Nature出版。

学术背景与目标
单细胞测序技术的快速发展使研究者能够深入解析细胞类型与亚群的异质性。早期技术仅支持最多1万个细胞的转录组分析，而当前技术可覆盖6万个甚至更多细胞。最初仅能分析mRNA表达，如今单细胞方法已扩展至表面分子表达、DNA可及性（ATAC-seq）、抗原特异性及B/T细胞受体（B cell receptor, BCR/T cell receptor, TCR）库分析。此外，空间转录组学与CRISPR筛选技术（结合单细胞转录组数据）也得到应用。

B/T细胞克隆的组成（如淋巴瘤/白血病中的恶性细胞或浸润性克隆）对肿瘤研究至关重要，因其可为肿瘤发展与控制提供线索。本章详细介绍了基于10× Genomics的Chromium系统和BD Rhapsody™系统的单细胞BCR/TCR受体库测序（single cell VDJ sequencing, scVDJ）方法，涵盖实验设计、样本制备、数据分析流程及空间分辨率技术的整合。

技术流程与方法学
1. 样本制备
- 起始材料：推荐使用新鲜或冷冻保存的单细胞悬液，避免使用甲醇固定或石蜡包埋组织（因RNA易降解）。
- 样本清洁：需通过过滤、离心或死细胞去除（如MACS微珠）提高细胞活性（>70%），减少细胞聚集体和碎片。
- 细胞富集：可采用磁激活分选（Magnetic Activated Cell Sorting, MACS）或流式分选（Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS）。例如，人B细胞富集需通过CD19微珠分选，结合FACS进一步纯化。

1. 单细胞VDJ测序平台

   • 10× Genomics系统：基于微流控液滴（GEMs）技术，每个液滴包裹单个细胞与带有独特条形码的凝胶珠，通过逆转录生成细胞特异性cDNA。兼容BCR/TCR测序、表面蛋白表达（CITE-seq）和CRISPR筛选。
     
   • BD Rhapsody™系统：采用微孔板技术，每个孔容纳单个细胞与poly-T标记磁珠，通过逆转录捕获全长cDNA。支持多组学分析（如靶向mRNA与VDJ联合检测）。
     

2. 空间分辨scVDJ测序

   • 10× Visium技术：保留组织内细胞位置信息，通过空间条形码寡核苷酸捕获mRNA。扩展方法支持BCR/TCR测序，需定制探针（如IDT杂交捕获探针）与长读长测序（PacBio）。
     

3. 数据分析流程

   • Cell Ranger软件：用于序列组装与克隆型（clonotype）分析，基于VDJ参考基因组（如人类GRCh38或小鼠mm10）比对。关键步骤包括：
     
     • Contig生成：通过CDR3序列鉴定功能性BCR/TCR。
       
     • 克隆型定义：使用Enclone算法，结合轻重链配对与体细胞超突变（somatic hypermutation, SHM）信息，误差率低至10^-9。
       
   • 输出文件：包括FASTA（序列）、CSV（注释）、BAM（比对）等格式，支持下游分析（如IgBLAST或IMGT注释）。
     

核心结果与意义
1. 技术优势：
- 单细胞分辨率下实现BCR/TCR全长测序，克服传统批量测序无法配对轻重链的局限。
- 空间转录组整合揭示肿瘤微环境中克隆的空间分布，如Engblom等（2023）通过Visium技术定位TCR克隆。

1. 应用价值：
   
   • 肿瘤研究：追踪淋巴瘤/白血病克隆演变，解析治疗耐药或复发机制。
     
   • 免疫学：解析B/T细胞发育阶段（如生发中心反应的SHM模式）及自身免疫疾病（如糖尿病）中的克隆扩增。
     

亮点与创新
1. 多组学兼容性：Chromium系统可同步分析基因表达（GEX）、蛋白标记（CITE-seq）与VDJ数据，支持高维度免疫图谱构建。
2. 低误差克隆分析：Enclone算法通过链配对与突变共享验证克隆关系，显著降低假阳性。
3. 空间技术突破：Visium HD版本实现单细胞级空间分辨率，推动微环境研究。

总结
本章系统梳理了scVDJ测序的技术流程与生物信息学策略，为免疫学与肿瘤学研究提供了标准化方法。其核心价值在于：
- 方法学标准化：详细对比10× Genomics与BD Rhapsody™的优劣，指导平台选择。
- 临床转化潜力：通过克隆追踪指导个体化治疗，如靶向特定BCR/TCR克隆的免疫疗法。

未来，结合长读长测序与人工智能分析（如克隆演化建模）将进一步拓展该技术的应用边界。