本研究的主要作者包括悉尼·R·戈登、罗伊·L·毛特、本·W·达尔肯、格雷戈尔·胡特尔、本森·M·乔治、梅丽莎·N·麦克拉肯等，通讯作者为欧文·L·韦斯曼。研究团队主要来自美国斯坦福大学医学院干细胞生物学与再生医学研究所、病理学系、路德维希癌症干细胞研究中心等多个机构，合作者还包括耶鲁大学医学院免疫生物学系等。这项研究成果以“Letter”形式发表于国际顶级学术期刊《自然》，在线发表日期为2017年5月17日，卷期信息为2017年5月刊，第000卷，DOI号为10.1038/nature22396。
本研究属于肿瘤免疫学领域，聚焦于免疫检查点调控机制。程序性细胞死亡蛋白1及其配体（PD-1/PD-L1）通路是已知的关键免疫检查点，主要功能是抑制T细胞活性，诱导免疫耐受。阻断该通路的单克隆抗体在多种癌症治疗中展现出显著临床疗效。然而，该通路在肿瘤微环境中其他免疫细胞，特别是肿瘤相关巨噬细胞中的作用尚不清楚。肿瘤相关巨噬细胞与患者不良预后相关，但其功能可被调控，例如通过阻断SIRPα–CD47相互作用可促进其吞噬肿瘤细胞。鉴于巨噬细胞在病原体感染中被报道可表达PD-1，研究人员推测在肿瘤微环境中，巨噬细胞也可能表达PD-1，并可能影响其抗肿瘤免疫功能。因此，本研究旨在探究PD-1在肿瘤相关巨噬细胞上的表达情况、其表达动态、对巨噬细胞吞噬功能的影响，以及PD-1/PD-L1阻断疗法是否可能通过直接作用于巨噬细胞而发挥抗肿瘤效应。
本研究包含一系列严谨的实验步骤，从现象观察到机制探究，再到治疗验证。
流程一：确认PD-1在肿瘤相关巨噬细胞上的表达。 研究首先在小鼠结肠癌CT26细胞系构建的免疫健全同源移植瘤模型中进行。移植三周后，通过流式细胞术分析发现，约50%的肿瘤相关巨噬细胞表达表面PD-1，而循环单核细胞或脾脏巨噬细胞则未检测到PD-1表达。免疫荧光显微镜进一步确认了存在大量同时表达巨噬细胞标志物CD68和PD-1的细胞群体。流式分析显示，几乎所有PD-1+的肿瘤相关巨噬细胞都呈现促肿瘤的M2样表型，而PD-1-的巨噬细胞则倾向于抗炎的M1样表型。动态观察发现，PD-1+肿瘤相关巨噬细胞群体并非静态，它在移植后约两周开始出现，并随时间推移而增加，其表达比例与移植后天数及肿瘤体积呈强相关。
流程二：验证人类肿瘤中PD-1的表达。 为了将小鼠研究发现推向临床相关性，研究团队对人类结直肠癌样本中的肿瘤相关巨噬细胞进行了分析。结果显示，人类肿瘤相关巨噬细胞也高度且异质地表达PD-1。与小鼠模型一致，M2亚群比M1亚群表达显著更多的PD-1，并且PD-1+的M2亚群比例随疾病分期的进展而增加，而M1亚群中则无此趋势。这表明在人类癌症中，M2型PD-1+肿瘤相关巨噬细胞可能在肿瘤微环境中随时间积累。
流程三：探究PD-1+肿瘤相关巨噬细胞的起源。 为了确定这些细胞的来源，研究进行了骨髓移植实验。将来自红色荧光蛋白标记的供体小鼠的骨髓移植到经辐照的绿色荧光蛋白标记的宿主小鼠体内。六周后，确认嵌合状态，再给这些小鼠接种MC38结肠癌细胞。三周后分析发现，肿瘤中PD-1+的肿瘤相关巨噬细胞和PD-1+的肿瘤浸润淋巴细胞绝大多数来源于供体骨髓衍生的循环白细胞，而非源自组织驻留的免疫细胞。
流程四：深入表征PD-1+肿瘤相关巨噬细胞的表型。 研究综合运用了多种技术进行表征。吉姆萨染色显示，PD-1+巨噬细胞体积大、呈“泡沫样”，充满空泡和/或脂质，而PD-1-巨噬细胞较小，更像单核细胞。电子显微镜证实，这种泡沫样外观部分是由于细胞质内积累了大量未清除的吞噬物质和溶酶体。流式分析进一步揭示，与PD-1-巨噬细胞相比，PD-1+巨噬细胞表达更多M2相关的清道夫受体CD206，更少的主要组织相容性复合体II类分子，以及更多的CD11c。值得注意的是，几乎所有PD-1+巨噬细胞和高比例的PD-1-巨噬细胞都表达通常与T细胞相关的标志物CD4，这在髓系细胞中也有报道。免疫荧光显微镜也确认了CD68和CD4在分选的肿瘤相关巨噬细胞上的共表达。
流程五：验证PD-1表达对巨噬细胞吞噬功能的抑制作用。 研究者提出假说：PD-1表达可能通过限制活化巨噬细胞的效应功能来影响其吞噬能力。体外实验首先验证了这一假说：从CT26肿瘤中分选出的PD-1+巨噬细胞，对绿色荧光标记的金黄色葡萄球菌生物颗粒的吞噬程度低于PD-1-巨噬细胞。为了在体内验证这种抑制并排除适应性免疫系统的干扰，研究使用了缺乏适应性免疫系统的免疫缺陷小鼠。在这些小鼠中，PD-1表达同样特异性出现在肿瘤相关巨噬细胞上，且与肿瘤体积相关。研究者构建了两种CT26细胞亚系：一种组成性过表达PD-L1，另一种敲除了PD-L1。在免疫缺陷小鼠中植入PD-L1过表达的肿瘤后，发现PD-1表达频率与体内总吞噬水平呈显著负相关。此外，流式分析显示，PD-1-巨噬细胞在体内吞噬的肿瘤细胞显著多于PD-1+巨噬细胞。
流程六：探究逆转PD-1抑制的可能性及其抗肿瘤效应。 为了确定这种吞噬抑制是否可通过去除配体PD-L1来逆转，研究者在免疫缺陷小鼠中同时植入了PD-L1过表达和PD-L1敲除的肿瘤。三周后，PD-L1敲除组的肿瘤显著小于过表达组。分析吞噬能力发现，去除PD-L1对PD-1-巨噬细胞的吞噬没有影响，但显著增强了PD-1+巨噬细胞的吞噬。PD-L1敲除并不直接影响PD-1+巨噬细胞的比例。这些结果表明，PD-1–PD-L1通路特异性地抑制了肿瘤相关巨噬细胞的功能，而阻断该通路可以“挽救”其功能并减少肿瘤负荷。
流程七：验证PD-1/PD-L1阻断疗法的直接抗肿瘤作用及机制。 为了证明这种增强的抗肿瘤免疫可以通过治疗性阻断PD-1–PD-L1相互作用来调控，研究者用PD-1阻断抗体或一种工程化的小型PD-L1阻断蛋白治疗荷瘤免疫缺陷小鼠。为了避免抗体与肿瘤细胞上可能表达的PD-1结合产生混淆，实验采用了人结肠癌DLD-1细胞异种移植模型。结果显示，无论是PD-1阻断还是PD-L1阻断治疗，都能等效地显著抑制肿瘤生长。重要的是，当使用特异性方案耗竭肿瘤相关巨噬细胞后，两种阻断治疗对肿瘤大小的效应均被消除。这直接证明了PD-1/PD-L1轴在肿瘤相关巨噬细胞上的特异性抑制是观察到的抗肿瘤疗效的原因，而非通过Fc介导的吞噬作用或其他机制。
流程八：探索PD-1/PD-L1阻断与抗CD47疗法的联合效应。 鉴于抗CD47疗法已进入早期临床试验，且可能与PD-1/PD-L1阻断联合使用，研究者探究了两者在巨噬细胞介导的免疫治疗中的相互作用。在DLD-1异种移植模型中，分别使用PD-L1阻断蛋白、抗CD47抗体以及两者联合进行治疗。结果显示，两种单药治疗均能等效地减小肿瘤体积，而联合治疗组显示出更强的肿瘤缩小趋势。生存分析表明，两种单药治疗组的小鼠生存期均显著长于对照组，而联合治疗组的生存期有进一步延长的趋势。
数据分析流程： 研究采用了严格的统计学方法。对于事先有明确假设的实验（如比较PD-1+与PD-1-巨噬细胞的吞噬能力），使用单尾检验；对于探索性分析，则使用双尾检验。数据以均值±标准误表示，并使用适当的统计模型进行分析，如配对单因素方差分析、配对t检验、双因素方差分析、指数增长方程拟合、相关性分析（斯皮尔曼或皮尔逊相关系数）以及生存分析的Log-rank检验。所有流式细胞术的门控策略均基于荧光减一对照和同型对照确定。
结果一： 成功在小鼠和人类肿瘤微环境中鉴定出高表达PD-1的肿瘤相关巨噬细胞亚群。该亚群主要呈现促肿瘤的M2样表型，其比例在小鼠模型中随肿瘤进展而增加，在人类患者中随疾病分期（特别是M2亚群内）而增加。
结果二： 骨髓移植实验证明，肿瘤中的PD-1+巨噬细胞主要来源于循环中的造血干细胞衍生的白细胞，而非组织原位巨噬细胞转化。
结果三： PD-1+巨噬细胞在形态和分子表型上均与PD-1-巨噬细胞存在显著差异，表现为“泡沫样”形态、高表达CD206和CD4、低表达MHC II。这表明PD-1标志着一个功能可能受到抑制的、独特的巨噬细胞亚群。
结果四： 体外和体内实验均证实，PD-1表达与巨噬细胞吞噬功能减弱相关。PD-1+巨噬细胞的吞噬能力低于PD-1-巨噬细胞，且PD-1表达水平与整体吞噬水平呈负相关。
结果五： 关键机制验证结果显示，去除或阻断PD-L1可以特异性地增强PD-1+巨噬细胞的吞噬能力，并抑制肿瘤生长，而对PD-1-巨噬细胞无影响。这直接证明了PD-1-PD-L1通路在抑制巨噬细胞功能中的作用。
结果六： 治疗性研究结果表明，PD-1或PD-L1阻断剂能通过依赖巨噬细胞的机制发挥抗肿瘤作用。巨噬细胞耗竭实验为此提供了最直接的证据，消除了阻断治疗的疗效。
结果七： 初步探索显示，PD-1/PD-L1阻断与抗CD47疗法在抑制肿瘤生长和延长生存期方面具有叠加或协同趋势，为联合免疫治疗提供了临床前依据。
这些结果环环相扣：从发现现象（PD-1在肿瘤相关巨噬细胞上表达），到表征该细胞亚群，再到验证其功能缺陷（吞噬抑制），继而通过基因敲除和药物阻断实验证实该通路是导致功能缺陷的原因并可被逆转，最后通过细胞耗竭实验确认该机制是PD-1/PD-L1阻断疗法的重要作用方式之一。每一步结果都为下一步的研究问题提供了依据和方向，并最终汇聚成完整的证据链，支持核心结论。
本研究得出结论：PD-1/PD-L1免疫检查点通路不仅调控适应性免疫细胞（如T细胞），也直接调控先天免疫系统的关键效应细胞——巨噬细胞。肿瘤相关巨噬细胞表达PD-1，其表达抑制了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬清除能力，从而促进了免疫逃逸和肿瘤进展。阻断PD-1/PD-L1相互作用可以解除这种抑制，直接激活巨噬细胞的抗肿瘤功能，这是该疗法除激活T细胞外的另一重要作用机制。
科学价值： 本研究拓宽了人们对PD-1/PD-L1通路功能范围的认识，将其从传统的适应性免疫检查点扩展为同时调控先天与适应性免疫的全局性免疫抑制机制。它揭示了一个此前被忽视的抗肿瘤免疫效应细胞——巨噬细胞——是如何被肿瘤利用PD-1通路所抑制的，为肿瘤免疫逃逸机制提供了新的见解。
应用价值： 这项研究具有重要的临床转化意义。首先，它解释了在某些情况下（如肿瘤细胞MHC I类分子表达缺失或T细胞浸润异质性大），PD-1/PD-L1阻断疗法仍能有效的原因，部分可能归功于巨噬细胞的直接激活。例如，文章提到在霍奇金淋巴瘤中，这种巨噬细胞介导的效应可能尤为重要。其次，研究为优化现有免疫治疗策略提供了新思路，例如合理设计针对巨噬细胞和T细胞的联合疗法。最后，研究表明抗PD-1/PD-L1与抗CD47联合治疗具有潜力，为临床试验中的药物组合提供了理论支持和实验依据。
本研究还展示了团队自主研发的实验工具的价值，例如文中使用的工程化高亲和力PD-1变体蛋白，它被用作一种无Fc结构域的小型PD-L1阻断剂。使用这种工具在巨噬细胞耗竭实验中至关重要，因为它排除了抗体Fc段介导的吞噬作用可能带来的解释复杂性，从而干净利落地证明了PD-L1通路阻断本身的效应。这体现了方法学创新对解决关键科学问题的重要性。
此外，研究中对PD-1+巨噬细胞“泡沫样”形态和内部充满未消化物质的超微结构描述，为理解其功能受损状态提供了直观的细胞生物学证据，将分子表型与细胞形态及功能缺陷紧密联系起来，增加了研究的深度和说服力。