本研究由台湾中兴大学食品科学与应用生物科技系的Siao-Ling Fan、Jer-An Lin、Sheng-Yi Chen、Jia-Hong Lin、Hsin-Tang Lin、Ying-Yin Chen以及Gow-Chin Yen等研究人员共同完成，其中Gow-Chin Yen为通讯作者。该研究成果于2020年8月18日投稿，2020年11月9日被接收，并于2020年11月23日在线发表于《Food & Function》期刊（Food Funct., 2021, 12, 119–132），论文DOI为10.1039/d0fo02180f。
本研究属于食品科学与糖尿病伤口愈合交叉领域的基础应用研究。糖尿病（diabetes）患者常伴随慢性伤口（chronic wounds）和感染性疾病，造成巨大的医疗负担。已有研究表明，糖尿病伤口愈合受损的机制与糖化应激（glycative stress）诱导的活性氧（reactive oxygen species, ROS）爆发、蛋白质糖化（protein glycation）以及免疫失衡密切相关。其中，二羰基化合物如甲基乙二醛（methylglyoxal, MG）可导致参与伤口愈合过程的成纤维细胞（fibroblasts）和巨噬细胞（macrophages）功能障碍，进而引起慢性炎症、血管生成受损和组织重塑不良。仙草（Hsian-tsao, Mesona procumbens Hemsl.）是一种在中国社会中常用于制作功能性饮料的植物材料，已有研究显示其具有强抗氧化和抗炎特性。本研究旨在评估仙草提取物及其多糖对糖尿病条件下受损伤口愈合的促进作用，为开发改善糖尿病伤口愈合的替代自然疗法提供科学依据。
研究的工作流程可分为样品制备与理化性质分析、细胞实验、动物实验以及组织病理与免疫组化分析等几个主要部分。在样品制备方面，仙草购自台湾新竹县关西镇当地市场，风干后用50%乙醇溶液提取24小时，冷冻干燥后得到仙草乙醇提取物（ethanol extracts of hsian-tsao, EE）。仙草粗多糖（crude polysaccharides from water extracts of hsian-tsao, WEP）则通过将风干仙草以1：10比例加水在121°C下提取20分钟，过滤后加入95%乙醇以1：4比例沉淀，离心后烘干获得。WEP的理化性质通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）、热场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）、差示扫描量热法（DSC）和热重分析（TGA）进行表征。结果显示WEP具有无定形结构，表面粗糙，热分解温度约为310°C。WEP的提取率约为2.3%，其中多糖含量为301.7 mg/g提取物，β-1,3-葡聚糖（β-1,3-glucan）含量为68.9 mg/g提取物。
细胞实验部分使用了RAW 264.7小鼠巨噬细胞和3T3-L1小鼠成纤维细胞。研究人员通过在高糖（25 mM）培养基中添加100–500 μM MG诱导模拟糖尿病皮肤溃疡的细胞模型，最终选择不显著影响细胞活力的100 μM MG浓度进行后续实验。EE和WEP的处理浓度筛选为0–200 μg/ml，根据细胞活力结果确定了后续实验剂量。在抗糖化实验中，采用MG-BSA模型评估EE和WEP对MG诱导蛋白质糖化的抑制作用。在ROS测定中，使用DCFH-DA荧光探针法检测细胞内ROS水平。炎症相关因子（IL-8、MCP-1、MIP-2）和伤口愈合相关因子（MMP-2、MMP-9、TIMP-1、VEGF）的蛋白表达通过Western blot分析检测。巨噬细胞吞噬实验则使用CellTracker Green标记的灭活金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）进行，通过荧光强度定量吞噬能力。
动物实验方面，采用链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导的C57BL/6小鼠糖尿病模型。8周龄雄性小鼠经连续7天腹腔注射65 mg/kg STZ建立糖尿病模型。伤口愈合模型通过在麻醉小鼠背部皮肤上使用8 mm一次性活检打孔器创建两个对称伤口，伤口分别用生理盐水、EE、WEP或氨基胍（aminoguanidine, AG）处理，每3天处理一次，并用3M Tegaderm防水敷料覆盖以防止感染。实验期间每3天记录体重和摄食饮水情况，并使用ImageJ软件量化伤口面积变化。实验结束后取背部皮肤进行组织病理学分析和免疫组化染色。
研究结果显示，EE和WEP对MG诱导的蛋白质糖化具有显著抑制作用，EE在10–200 μg/ml浓度下抑制率约为50%，WEP在25–200 μg/ml浓度下抑制率约为70%。在ROS产生方面，10 μM MG可显著诱导RAW 264.7细胞产生ROS，而EE和WEP（12.5–50 μg/ml）均能剂量依赖性地抑制MG诱导的ROS产生。在炎症因子表达方面，100 μM MG可显著增加RAW 264.7细胞中IL-8、MIP-2和MCP-1的蛋白表达，EE和WEP处理能显著降低这些因子的表达，且WEP的抑制效果优于EE。在伤口愈合因子方面，MG可显著增加3T3-L1成纤维细胞中MMP-2和MMP-9的表达，同时降低TIMP-1和VEGF的表达。EE和WEP均能剂量依赖性地逆转MG引起的这些改变，其中WEP对VEGF的恢复作用优于EE。在吞噬实验方面，MG处理对巨噬细胞吞噬S. aureus和P. aeruginosa的能力影响不显著，但EE和WEP能剂量依赖性地增强MG处理巨噬细胞的细菌吞噬能力。
动物实验结果进一步证实了EE和WEP的伤口愈合促进作用。在正常小鼠中，EE和WEP处理组伤口面积在造模后第6天即显著小于未处理组。在糖尿病小鼠中，EE和WEP处理组伤口面积在第9天显著小于未处理组。组织病理学评分显示，糖尿病小鼠经EE或WEP（50 μg/ml）处理后，皮肤组织的痂皮和表皮形成程度降低，炎症和血管生成程度降低，肉芽组织形成和再上皮化程度显著提高。免疫组化分析也证实EE和WEP对MIP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白表达的调节作用与上述结果一致。
本研究的结论认为，仙草提取物及其多糖对糖化应激诱导的糖化、ROS产生以及巨噬细胞和成纤维细胞功能障碍具有显著的抑制作用，并能显著改善糖尿病小鼠的伤口愈合延迟。因此，仙草干预可被视为糖尿病慢性伤口的一种替代疗法。本研究的科学价值在于首次系统阐明了仙草及其多糖在糖尿病伤口愈合中的作用机制，特别是在MG诱导的细胞功能障碍模型中的保护作用。其应用价值在于为开发基于天然植物的糖尿病伤口护理产品提供了科学依据。本研究的亮点包括：首次报道了仙草提取物及其多糖对MG诱导的巨噬细胞和成纤维细胞功能障碍的保护作用；结合细胞模型和动物模型系统验证了仙草的伤口愈合促进作用；并对其活性成分（多糖和β-1,3-葡聚糖）进行了定量分析。此外，研究还发现与阳性对照氨基胍相比，EE和WEP对铜绿假单胞菌吞噬作用无不良影响，这进一步体现了仙草作为天然替代疗法的潜在优势。