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蛋白激酶A通过磷酸化ALKHB5调控GPX4的m6A修饰从而调控铁死亡

一、作者及发表信息
本研究由Xiaocheng Zhao（第一作者兼通讯作者）、Yanxi Sun（共同第一作者）等来自中山大学附属第七医院、华南理工大学医学院、浙江大学医学院等10家机构的团队完成，于2025年2月发表于*Cell Death & Differentiation*（影响因子未明确，DOI: 10.1038/s41418-025-01453-3）。

二、研究背景与目标
科学领域：细胞死亡调控与肿瘤治疗。
背景知识：铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的非凋亡性细胞死亡形式，由脂质过氧化驱动，其关键抑制因子GPX4通过还原脂质过氧化物维持细胞存活。近年研究发现，靶向GPX4的铁死亡诱导是癌症治疗的潜在策略，但GPX4的调控机制尚不完善。蛋白激酶A（PKA）是经典的cAMP依赖性激酶，参与多种生理过程，但其与铁死亡的关系未见报道。
研究目标：揭示PKA是否通过调控GPX4影响铁死亡，并阐明其分子机制。

三、研究流程与方法
1. PKA缺失促进铁死亡的验证
- 研究对象：人纤维肉瘤细胞HT-1080，通过CRISPR-Cas9构建PKA敲除（KO）细胞系。
- 实验设计：
- 用铁死亡诱导剂（RSL3、erastin、FIN56）处理细胞，检测细胞活力（CCK-8法）、脂质过氧化（BODIPY荧光探针）和细胞死亡（SYTOX Green染色）。
- 结果：PKA KO细胞对诱导剂更敏感，且铁死亡抑制剂Ferrostatin-1可逆转此效应（图1a-1j）。
- 创新方法：结合基因集富集分析（GSEA）证实PKA缺失激活铁死亡通路（图S2a）。

1. GPX4作为PKA调控铁死亡的关键靶点

   • 筛选实验：通过Western blot和qPCR检测PKA KO细胞中已知铁死亡相关基因的表达，发现仅GPX4在蛋白和mRNA水平显著下调（图2a-2c）。
     
   • 功能验证：过表达GPX4可挽救PKA KO细胞的铁死亡敏感性（图2d-2k）。
     

2. PKA通过磷酸化ALKHB5调控GPX4的m6A修饰

   • 机制探索：
     
     • 互作验证：GST pull-down和免疫共沉淀（Co-IP）证实PKA与RNA去甲基酶ALKHB5直接结合（图3a）。
       
     • 磷酸化位点鉴定：体外激酶实验和LC-MS/MS确定PKA磷酸化ALKHB5的第361位丝氨酸（S361）（图3b-3f）。
       
     • 功能影响：磷酸化促进ALKHB5降解，而S361A突变体稳定性增强（图3h-3k）。
       
   • 下游效应：
     
     • PKA缺失导致ALKHB5积累，降低GPX4 mRNA的m6A修饰（减少稳定性）（图4i）。
       
     • ALKHB5 KO细胞中GPX4的m6A修饰增加，抑制铁死亡（图5a-5r）。
       

3. PKA-ALKHB5-GPX4轴在肿瘤中的功能验证

   • 体内实验：在小鼠黑色素瘤B16-F10模型中，PKA敲低抑制肿瘤生长，而ALKHB5共敲除可逆转此效应（图7g-7h）。
     
   • 临床相关性：在A375（人黑色素瘤）和H1299（非小细胞肺癌）细胞中重复验证该通路。
     

四、主要结果与逻辑链条
1. 结果递进：
- PKA缺失→铁死亡敏感性↑→GPX4表达↓→机制不明→发现ALKHB5磷酸化→ALKHB5降解减少→GPX4 m6A修饰↓→GPX4稳定性↓→铁死亡↑。
2. 关键数据：
- 图3e-3f：LC-MS/MS直接证明S361磷酸化；
- 图6b-6c：PKA/ALKHB5双敲除（DKO）完全逆转GPX4下调；
- 图7i：提出“PKA-ALKHB5-GPX4”轴调控铁死亡的模型。

五、研究结论与价值
1. 科学意义：
- 首次揭示PKA通过磷酸化ALKHB5调控RNA表观修饰（m6A）影响铁死亡的新机制，拓展了PKA的非经典功能。
- 阐明GPX4转录后调控的精确通路，为铁死亡研究提供新靶点。
2. 应用价值：
- PKA抑制剂（如H89）或ALKHB5激动剂可能增强肿瘤对铁死亡诱导剂的敏感性。
- 为癌症联合治疗（如化疗+铁死亡诱导）提供理论依据。

六、研究亮点
1. 创新发现：
- ALKHB5是PKA的新底物，其磷酸化依赖的降解机制为首次报道。
- 提出“激酶-RNA修饰酶-铁死亡”的跨维度调控网络。
2. 技术突破：
- 结合化学遗传学筛选（图S5a）和LC-MS/MS精准定位磷酸化位点。
- 多模型验证（细胞系、小鼠移植瘤）。

七、其他价值
- 研究涉及多种癌症类型（肉瘤、黑色素瘤、肺癌），提示通路的普适性。
- 补充数据包含详细的实验方法（如MerIP-qPCR、Dot blot等），可供方法学参考。

（注：全文约2000字，涵盖研究全貌，重点突出机制解析与跨学科意义。）