本研究由 Azucena Ramos, Catherine E. Koch, Yunpeng Liu-Lupo 等来自麻省理工学院、麻省总医院、哈佛医学院、博德研究所等机构的科研团队共同完成，于 2023 年发表在《自然-通讯》（*Nature Communications*）杂志上，题为《通过体内迭代全基因组CRISPR筛选揭示CAR-T反应的白血病内在决定因素》（*Leukemia-intrinsic determinants of CAR-T response revealed by iterative in vivo genome-wide CRISPR screening*）。
本研究属于肿瘤免疫学和血液肿瘤学领域，旨在深入探索导致患者对嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T-Cell， CAR-T）疗法耐药的、源自白血病细胞本身的内在机制。CAR-T疗法在治疗B细胞恶性肿瘤（如急性B淋巴细胞白血病， B-ALL）方面取得了突破性成功，但仍有大量患者出现复发，主要机制包括CAR-T细胞功能丧失和靶抗原丢失。然而，除了这些已知机制外，肿瘤细胞内部是否存在其他关键的抵抗通路尚不完全清楚。特别是，研究界对于干扰素-γ（IFNγ）信号通路在CAR-T耐药中的作用存在矛盾报道，其在体外和免疫缺陷模型中可能促进耐药，而在某些免疫健全的体内模型中可能增强敏感性。为了在生理更相关的免疫健全环境中，系统、无偏地揭示B-ALL细胞对CAR-T疗法的内在抵抗机制，本研究设计并实施了一套创新的体内全基因组功能缺失筛选策略，并将筛选结果与体外实验、转录组分析及患者数据关联验证，最终发现了一个由肿瘤微环境诱导、依赖于IFNγR/JAK/STAT信号和抗原呈递通路、涉及自然杀伤（NK）细胞参与的“适应性”耐药程序。
研究流程详述： 本研究主要包含以下几个核心步骤，构建了一个从筛选发现到机制验证的完整研究体系。
1. 建立免疫健全的CAR-T疗法小鼠模型及筛选平台： 研究团队首先使用一个已建立的、可在免疫健全的C57BL/6小鼠中高效植入的Bcr-Abl+ B-ALL小鼠模型。他们构建了稳定表达Cas9的B-ALL细胞系，并验证其在小鼠体内生长时不会因Cas9表达而引发免疫排斥，这确保了后续筛选的有效性。为了模拟临床治疗，研究采用了淋巴清除（照射）后移植肿瘤细胞，再回输CAR-T细胞的方案。通过剂量摸索实验，确定了能够实现显著（约80-90%）但非完全清除肿瘤的CAR-T细胞剂量，以利于筛选出能“增敏”或“抵抗”CAR-T的基因。同时，体外建立了共培养杀伤实验体系以并行比较。
2. 开发新型模块化sgRNA文库并进行迭代式全基因组CRISPR筛选： 这是本研究的核心创新方法。团队设计并构建了一个名为“SKY”的新型全基因组单导向RNA（single guide RNA, sgRNA）文库。该文库的独特之处在于其模块化设计：将靶向小鼠所有21,958个蛋白编码基因的sgRNA（每基因4条），根据基因的KEGG通路分类，非冗余地分配到48个独立的子库中，每个子库约含456个基因。所有靶向同一基因的sgRNA都在同一个子库内。这种设计允许根据肿瘤模型在体内的植入率高低，灵活地将子库组合成不同大小的混合库进行筛选。由于本研究的B-ALL模型植入效率高，团队将48个子库每8个一组，合并成6个大型混合库进行平行筛选。 筛选流程采用迭代式策略： * 初级筛选（Primary Screen）：将感染了上述6个混合sgRNA文库的Cas9+ B-ALL细胞，分别在体内（经照射的小鼠）和体外接受靶向小鼠CD19（mCD19）的CAR-T细胞或靶向人EGFRVIII（非小鼠表达，作为对照）的CAR-T细胞处理。体内部分，在CAR-T治疗后收集从脾脏和骨髓中复发或残存的肿瘤细胞。体外部分，设置了两种效应细胞与靶细胞比例。随后，通过流式分选回收带有sgRNA的B-ALL细胞，进行高通量测序，分析不同处理组中sgRNA的相对丰度变化。富集的sgRNA指示其靶基因的缺失赋予肿瘤细胞对CAR-T的抵抗性；耗竭的sgRNA则指示其靶基因的缺失使肿瘤细胞对CAR-T更敏感。 * 验证筛选（Validation Screen）：由于初级筛选是分库进行的，难以直接跨库比较所有sgRNA的效应。为此，研究团队从初级筛选中各库的排名靠前（无论富集还是耗竭）的基因中，选取了933个基因，并为每个基因新设计了6条sgRNA，构建了一个集中的验证文库。使用该验证文库重复上述体内外筛选流程，从而能够对所有候选基因的sgRNA效应进行统一排名和确认。
3. 体内外功能验证实验： 基于筛选结果，研究团队对关键候选基因进行了多层次的功能验证。 * 竞争性增殖实验：将用荧光标记的、经CRISPR敲除特定基因（如*Ifngr1*、*Jak2*、*Stat1*）的B-ALL细胞与对照野生型细胞按1:1混合，共同移植到小鼠体内或共培养于体外，再给予CAR-T治疗。通过流式细胞术追踪特定基因缺失细胞在群体中比例的变化，直观验证其在体内（应耗竭）和体外（应富集）对CAR-T反应的相反表型。 * 克隆细胞系生存实验：构建纯合的*Ifngr1*、*Jak2*、*Stat1*基因敲除B-ALL单克隆细胞系，将其单独移植到小鼠体内，观察接受CAR-T治疗后小鼠的生存期，直接证实这些基因缺失能显著延长生存、抑制复发。 * 药理学干预实验：在CAR-T治疗的同时，给予小鼠IFNγ中和抗体或JAK1/2抑制剂（鲁索替尼），观察全局阻断IFNγ信号通路对CAR-T疗效的影响。
4. 转录组学分析： 为了从分子表型上印证筛选结果并探索耐药细胞的特性，研究对经CAR-T处理后的体内肿瘤细胞进行了批量RNA测序和单细胞RNA测序（scRNA-seq）。分析聚焦于比较靶向CD19的CAR-T组与对照组肿瘤细胞之间的基因表达差异，并对复发肿瘤细胞进行无监督聚类，识别具有特定表达特征的细胞亚群。
5. 机制深入探究与临床相关性分析： * 焦点基因H2-T23（编码QA-1b）：筛选发现编码非经典MHC I类分子QA-1b（人HLA-E的同源物）的基因*H2-T23*是体内最显著的“增敏”靶点之一（其sgRNA耗竭）。研究证实，IFNγR/JAK/STAT信号通路的缺失会导致肿瘤细胞无法诱导QA-1b表达。构建*H2-T23*敲除的B-ALL细胞系，证实其在小鼠体内对CAR-T治疗更敏感。进一步，使用阻断性抗体抑制QA-1b的受体NKG2A（表达于NK细胞和部分T细胞上），发现能显著增强CAR-T的疗效，延长小鼠生存。 * NK细胞作用探究：使用抗NK1.1抗体在体内清除NK细胞，意外地发现这也能增强CAR-T的疗效，提示NK细胞在肿瘤微环境中可能通过提供IFNγ等方式，间接诱导了肿瘤细胞的耐药程序。 * 患者数据关联：分析已发表的、来自接受抗人CD19 CAR-T治疗的B-ALL患者的预处理骨髓样本RNA-seq数据。构建基于小鼠筛选“增敏”基因和JAK/STAT/MHC-I耐药特征的基因签名，发现这些签名在治疗无效患者中的表达水平显著高于完全缓解者，将小鼠模型的发现与临床预后联系起来。
主要研究结果： 1. 体内外筛选揭示完全相反的IFNγ通路作用模式：初级和验证筛选均一致表明，靶向IFNγR/JAK/STAT信号通路关键组件（如Ifngr1, Jak2, *Stat1*）的sgRNA在体外CAR-T共培养中显著富集（即基因缺失导致耐药），但在体内（脾脏和骨髓）却显著耗竭（即基因缺失导致增敏）。这清晰地揭示了该通路在CAR-T反应中具有强烈的环境依赖性。 2. 鉴定出核心耐药介质QA-1b/HLA-E轴：验证筛选将*H2-T23*（QA-1b）确定为体内最重要的增敏靶点之一。功能实验证明，*Ifngr1*、*Jak2*或*Stat1*的缺失会完全阻断IFNγ诱导的QA-1b表达。*H2-T23*敲除的肿瘤在免疫健全小鼠中对CAR-T治疗表现出更强的敏感性，且这种敏感性在缺乏NK细胞的免疫缺陷小鼠中减弱。使用抗NKG2A阻断抗体可模拟基因敲除效果，显著提升CAR-T疗效。 3. 揭示NK细胞在耐药微环境中的复杂角色：NK细胞耗竭实验（使用抗NK1.1抗体）增强了CAR-T疗效，结合QA-1b的上游诱导依赖于IFNγ信号，提示肿瘤微环境中的NK细胞可能是IFNγ的重要来源，其通过诱导肿瘤细胞表达QA-1b等抑制性分子，间接削弱了CAR-T的攻击效果。这表明内源性免疫在CAR-T治疗中具有“双刃剑”效应。 4. 转录组分析确认适应性耐药程序：批量RNA-seq显示，经CAR-T治疗后残存的肿瘤细胞高表达JAK/STAT通路和抗原处理呈递通路相关基因。scRNA-seq进一步鉴定出几个特异性富集于CAR-T治疗组小鼠肿瘤细胞的亚群（如簇2、4、7），这些亚群均高表达IFNγ应答、MHC-I类（包括*H2-T23*）以及细胞周期相关基因，描绘出一个由CAR-T引发的炎症信号所塑造的耐药肿瘤微环境图谱。 5. 临床相关性验证：对患者数据的分析表明，在CAR-T治疗前，白血病细胞中高表达JAK/STAT/MHC-I相关基因特征与不良临床结局（治疗无效）显著相关。这为将小鼠模型中发现的核心机制转化为潜在的患者分层生物标志物提供了初步证据。 6. 对“间接杀伤”与“直接杀伤”机制的见解：研究还观察到，缺失*Ptpn2*或*Fitm2*等负调控IFNγ信号的基因，会使肿瘤细胞对IFNγ介导的细胞死亡极度敏感，导致其在体内外均对CAR-T增敏。这提示在某些条件下，CAR-T可以通过释放IFNγ间接杀伤肿瘤细胞，而在其他条件下（如存在完整IFNγR信号时），直接细胞接触杀伤占主导。两种机制的比重可能因组织部位（如脾脏vs骨髓）和肿瘤细胞状态而异。
研究结论与价值： 本研究发现并证实，在免疫健全的体内环境中，B-ALL细胞可以通过激活其固有的IFNγR/JAK/STAT信号通路，进而上调抑制性分子QA-1b（HLA-E）的表达，从而获得对CAR-T疗法的抵抗能力。这一过程受到肿瘤微环境（特别是NK细胞来源的IFNγ）的驱动，是一种“适应性”或“治疗诱导性”的耐药机制。该机制完美解释了为何IFNγ通路在简单的体外共培养模型中表现为促进CAR-T杀伤（此时IFNγ主要作为杀伤因子），而在复杂的免疫健全体内模型中却表现为促进抵抗（此时IFNγ先诱导了保护性分子的表达）。
本研究的科学价值在于：第一，首次在免疫健全的动物模型中实施了全基因组规模的体内CRISPR筛选来研究CAR-T耐药，克服了传统体外和免疫缺陷模型无法模拟肿瘤微环境相互作用的重大局限。第二，揭示了IFNγ信号在CAR-T治疗中复杂且具有环境依赖性的“双刃剑”角色，调和了此前该领域看似矛盾的研究发现。第三，鉴定出QA-1b/NKG2A轴是一个全新的、可操作的CAR-T耐药机制，为联合疗法提供了明确的靶点。第四，开发的模块化、可扩展的sgRNA文库和迭代筛选流程，为未来在各种体内肿瘤模型中进行功能性遗传筛选建立了方法论范本。
应用价值方面，本研究直接提出了两种潜在的临床转化策略：一是将抗NKG2A抗体（如Monalizumab）与CAR-T疗法联合使用，以阻断肿瘤细胞诱导的抑制性信号，目前已有抗NKG2A抗体在进行癌症临床试验，这种联合策略具有较高的可行性；二是利用鉴定出的JAK/STAT/MHC-I基因表达特征，对即将接受CAR-T治疗的患者进行风险分层，识别出可能对单药CAR-T反应不佳的高危患者，从而指导其尽早接受联合治疗。
研究亮点： 1. 方法学突破：创建并成功应用了首个模块化、可迭代的体内全基因组CRISPR筛选平台，解决了在体内复杂环境中进行高通量功能性遗传筛选的技术难题。 2. 机制发现新颖：发现由肿瘤微环境诱导、经IFNγR/JAK/STAT信号传导、最终通过QA-1b/NKG2A轴抑制CAR-T功能的完整耐药通路，这是一个此前未被充分认识的适应性抵抗机制。 3. 揭示复杂相互作用：深刻阐明了NK细胞等内源性免疫成分在CAR-T疗效中既可能有益（协助抗肿瘤）也可能有害（诱导肿瘤抵抗）的双重作用，强调了研究免疫健全模型的重要性。 4. 贯穿性验证体系：从无偏筛选到基因验证、从分子表型到细胞功能、从小鼠模型到患者数据，构成了一个逻辑严密、证据链完整的强大研究体系。 5. 明确的转化前景：直接指向抗NKG2A抗体这一已有临床开发基础的药物作为联合治疗策略，并提出了可用于患者分层的生物标志物，具有清晰的临床转化路径。