针对实体肿瘤免疫抑制微环境的新型双模块纳米抗体CAR-T细胞技术平台
一、 主要作者、机构及发表信息
本研究由来自中国多个研究机构的团队共同完成。主要作者包括Yangzi Li（第一作者，广西医科大学口腔医学院、南京医科大学附属苏州医院）、Xuan Wang（第一作者，华中科技大学同济医学院附属协和医院）、ShangKun Zhang（第一作者，武汉博锐德生物科技有限公司）等。通讯作者为Xiaoling Lu（广西医科大学）、Xiaobing Jiang（华中科技大学同济医学院附属协和医院）和Xiaomei Yang（广西医科大学）。该研究于2026年发表在《Journal of Hematology & Oncology》期刊上，目前处于“in press”（待刊）状态。
二、 学术背景与研究目标
科学领域： 本研究属于肿瘤免疫治疗领域，具体聚焦于针对实体瘤的嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T-Cell, CAR-T）疗法的创新与改进。
研究背景与动因： CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了革命性成功，但在实体瘤治疗中面临巨大挑战。这些挑战主要源于两个方面：一是肿瘤抗原的异质性和丢失；二是实体瘤高度免疫抑制性的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）。肿瘤微环境中的癌症相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs）是构成物理屏障和免疫屏障的核心组分，它们通过分泌细胞外基质和免疫抑制因子（如TGF-β）阻碍T细胞浸润和功能。此外，系统性使用免疫检查点抑制剂（如抗CTLA-4抗体）虽能增强免疫反应，但常伴随严重的全身性免疫相关不良事件（Immune-Related Adverse Events, irAEs），限制了其临床应用。
研究目标： 为了同时克服实体瘤的物理屏障和免疫抑制屏障，本研究旨在开发并验证一种创新的“双模块纳米抗体”CAR-T细胞平台（Dual-Modular-Nanobody CAR-T, DMN CAR-T）。该平台设计具备双重功能：1）通过靶向CAFs表面高表达的成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast Activation Protein, FAP），直接清除肿瘤基质屏障；2）通过CAR-T细胞在肿瘤局部分泌抗CTLA-4纳米抗体（Nanobody），实现对肿瘤微环境的原位免疫调节，解除局部免疫抑制，同时避免系统性毒性。
三、 详细研究流程与方法
本研究是一个综合性的临床前与早期临床探索，流程涵盖了技术平台构建、体外功能验证、体内疗效与安全性评估，以及一项初步的临床病例应用。
1. 技术平台构建与验证： * 研究对象与方法： 研究团队构建了名为“FAP/CTLA-4-DMN CAR-T”的慢病毒载体。该载体编码一个靶向FAP的纳米抗体CAR，并通过内部核糖体进入位点（IRES）连接一个分泌型的抗CTLA-4纳米抗体序列。CAR结构包含CD8跨膜区、4-1BB共刺激域和CD3ζ信号域，并带有His标签和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因。使用该载体转导健康供体外周血来源的T细胞，制备CAR-T细胞。 * 实验与验证： 通过流式细胞术检测GFP和His标签表达，确认CAR-T细胞的转导效率和表面CAR表达。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清，证实了CTLA-4纳米抗体的有效分泌。通过ELISA和竞争性结合实验，验证了分泌的纳米抗体能有效结合CD80并阻断CD80-CTLA-4的相互作用。在混合淋巴细胞反应（MLR）中，添加该CAR-T细胞上清液能增强T细胞分泌IFN-γ和IL-2，此效应可被可溶性CTLA-4竞争性阻断，证明了分泌的纳米抗体具有功能性免疫检查点阻断活性。
2. 体外功能与特性评估： * 研究对象： 制备的FAP/CTLA-4-DMN CAR-T细胞、对照CAR-T细胞（如仅靶向FAP的CAR-T、分泌无关纳米抗体的CAR-T等），以及FAP阳性（如HEPG2-FAP、U87）和阴性（HEPG2）的肿瘤细胞系。 * 实验流程： * 抗原识别与激活： 通过流式细胞术验证CAR-T细胞对重组FAP蛋白的特异性识别。与靶细胞共培养后，检测CAR-T细胞的激活标志物（CD25, CD69）和分化状态（CCR7, CD45RA）。 * 细胞毒性： 在不同效靶比下，将CAR-T细胞与荧光标记的靶细胞共培养，通过流式细胞术检测7-AAD阳性死细胞比例，评估特异性杀伤能力。加入可溶性FAP蛋白进行阻断实验，验证杀伤的特异性。 * 细胞因子分泌： 通过ELISA和酶联免疫斑点（ELISpot）检测CAR-T细胞与不同靶细胞共培养后上清中IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平。 * 抗耗竭能力： 将CAR-T细胞与FAP阳性靶细胞进行长达两周的慢性共培养，模拟持续抗原刺激。之后，检测CAR-T细胞表面耗竭标志物（PD-1, LAG-3, TIM-3）的表达水平。再将恢复的CAR-T细胞与新鲜靶细胞进行再挑战，评估其细胞因子分泌和细胞毒功能的保留情况。
3. 体内疗效与安全性评估（临床前动物模型）： * 研究对象： 免疫缺陷的NOD/SCID小鼠，分别接种HEPG2-FAP、U87细胞或患者来源的胶质瘤异种移植（Patient-Derived Xenograft, PDX）模型建立实体瘤。 * 实验流程： * 疗效评估： 当肿瘤体积达到约100 mm³时，小鼠被随机分组，接受FAP/CTLA-4-DMN CAR-T细胞或不同对照治疗（如PBS、未转导T细胞、单靶向CAR-T等）。通过尾静脉每周注射一次，共两次。定期测量肿瘤体积和小鼠生存期。 * 安全性评估： 治疗结束后，通过组织病理学检查主要器官（心、肝、脾、肺、肾、脑）评估毒性。检测血清中的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和血尿素氮（BUN）水平以评估肝肾功能。监测体重变化和血清IL-6水平以评估全身炎症和细胞因子释放综合征（Cytokine Release Syndrome, CRS）风险。 * 机制探索： 治疗结束后，取肿瘤组织进行免疫组化（IHC）分析FAP表达和肿瘤清除情况。通过免疫荧光染色检测CAR-T细胞在肿瘤组织中的浸润情况。
4. 初步临床病例应用： * 研究对象： 一名对多种疗法无效的复发性高级别胶质瘤（胶质母细胞瘤）患者。 * 实验流程： 这是一项I期临床试验的一部分。患者经检测肿瘤组织高表达FAP和CTLA-4。治疗方案采用鞘内注射（Intrathecal Infusion）方式，每周一次，连续三周，休息一个月为一个周期，输注FAP/CTLA-4-DMN CAR-T细胞。密切监测临床反应、不良事件，并通过影像学（CT）评估肿瘤变化。同时，动态检测患者脑脊液（Cerebrospinal Fluid, CSF）和外周血中的细胞因子（如IL-6, IFN-γ）水平。 * 肿瘤微环境分析： 对治疗前后的肿瘤样本（来自PDX模型和临床患者）进行批量转录组测序（Bulk RNA-seq）和多重免疫荧光染色（Multiplex Immunofluorescence Staining），分析肿瘤微环境的基因表达谱和免疫细胞浸润的变化。
5. 数据分析方法： 流式细胞术数据使用FlowJo软件分析。实验数据使用GraphPad Prism软件进行统计分析，两组比较采用Student’s t检验，多组比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。小鼠生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验。转录组数据分析包括差异表达基因筛选、KEGG通路富集分析（KEGG Pathway Analysis）和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）。
四、 主要研究结果
1. 成功构建并验证了功能性FAP/CTLA-4-DMN CAR-T平台： 研究证实了CAR-T细胞能稳定表达FAP CAR并有效分泌具有生物活性的抗CTLA-4纳米抗体。该分泌的纳米抗体能剂量依赖性地结合CD80并阻断其与CTLA-4的相互作用，在MLR中增强T细胞活化。
2. FAP/CTLA-4-DMN CAR-T在体外展现出强大的特异性抗肿瘤功能： * 特异性杀伤： 该CAR-T细胞能高效、特异性地杀伤FAP阳性的肿瘤细胞（HEPG2-FAP, U87），而对FAP阴性的HEPG2细胞无显著杀伤。杀伤效果具有效靶比依赖性，并可被可溶性FAP阻断。 * 强效激活与细胞因子释放： 被FAP阳性细胞刺激后，FAP/CTLA-4-DMN CAR-T细胞高表达激活标志物（CD25+, CD69+），并分泌高水平的IFN-γ、TNF-α和IL-2，分泌量与靶细胞FAP表达水平正相关。 * 改善分化状态与抗耗竭： 与对照CAR-T相比，FAP/CTLA-4-DMN CAR-T细胞表现出更高的初始（Naïve）和中央记忆型（Tcm）T细胞比例，提示其具有更好的持久性潜力。在长期抗原刺激下，其耗竭标志物（PD-1, LAG-3, TIM-3）的表达显著低于单靶向FAP的CAR-T细胞。再挑战时，其细胞因子分泌和细胞毒功能保留得更完好。
3. FAP/CTLA-4-DMN CAR-T在体内有效抑制实体瘤生长并延长生存期： 在HEPG2-FAP、U87以及胶质瘤PDX小鼠模型中，FAP/CTLA-4-DMN CAR-T治疗均能显著抑制肿瘤生长，并延长荷瘤小鼠的生存期。免疫组化和免疫荧光证实，治疗后肿瘤内FAP阳性细胞减少，CAR-T细胞成功浸润肿瘤组织。
4. FAP/CTLA-4-DMN CAR-T展现出良好的安全性： 在动物模型中，该疗法未引起明显的器官病理损伤，肝肾功能指标（ALT, AST, BUN）正常，体重稳定，且血清IL-6水平低，表明其CRS风险较低，安全性良好。
5. 初步临床病例显示疾病稳定与局部免疫激活： 在一名难治性胶质母细胞瘤患者中，鞘内输注FAP/CTLA-4-DMN CAR-T细胞后，患者耐受性良好，未发生≥3级的严重不良事件、CRS或免疫效应细胞相关神经毒性综合征（Immune Effector Cell-Associated Neurotoxicity Syndrome, ICANS）。影像学评估显示肿瘤未进展，有缩小趋势。脑脊液中IL-6和IFN-γ水平在输注后升高，而外周血细胞因子水平无显著变化，证明了治疗的局部激活效应和良好的靶向性。
6. 肿瘤微环境重塑的证据： 对治疗后的肿瘤样本分析显示，转录组水平上，与效应功能（GZMB, IFNG）、T细胞激活（IL2RA）相关的基因上调，而免疫抑制分子（LAG3, CTLA4）相关基因下调。通路富集分析显示T细胞受体信号、NK细胞介导的细胞毒性等免疫相关通路被激活。多重免疫荧光染色也直观显示了治疗后肿瘤核心区免疫细胞（如CD3+ T细胞、CD56+ NK细胞等）浸润增加。这些结果共同提示，FAP/CTLA-4-DMN CAR-T治疗能够重塑肿瘤微环境，使其向免疫激活状态转变。
五、 研究结论与意义
本研究成功开发并验证了一种新型的双模块纳米抗体CAR-T细胞平台（FAP/CTLA-4-DMN CAR-T）。该平台通过靶向清除FAP+的癌症相关成纤维细胞来破坏实体瘤的物理/基质屏障，并同时在肿瘤局部原位分泌抗CTLA-4纳米抗体来解除免疫抑制，从而协同增强抗肿瘤免疫应答。
科学价值： 1. 创新性设计： 首次报道了同时采用纳米抗体构建CAR识别模块和分泌型免疫调节模块的双功能平台，充分利用了纳米抗体体积小、穿透性强、避免链错配的优势。 2. 机制协同： 明确了“基质清除”与“局部免疫检查点阻断”双管齐下的协同作用机制，为克服实体瘤CAR-T治疗障碍提供了新的思路。 3. 功能优化： 证明该设计不仅能增强CAR-T细胞的即时杀伤功能，还能改善其分化状态（偏向记忆表型），并增强其在持续抗原刺激下的抗耗竭能力，这对其体内持久性至关重要。
应用价值与前景： 1. 疗效与安全性： 临床前研究和初步临床病例表明，该疗法在抑制实体瘤生长、延长生存期的同时，具有可控的安全性，特别是通过局部给药（如鞘内注射）可能进一步降低系统毒性。 2. 临床转化潜力： 为治疗FAP阳性、免疫抑制性强的实体瘤（如胶质母细胞瘤、胰腺癌等）提供了一种有前景的新策略。研究已进入早期临床试验阶段。 3. 平台技术启示： 这种模块化设计理念可扩展至其他靶点（如其他肿瘤基质靶点或免疫检查点），为开发下一代针对实体瘤的联合细胞疗法提供了可借鉴的技术框架。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的要点
研究团队坦诚地指出了本研究的局限性：所使用的NOD/SCID免疫缺陷小鼠模型缺乏完整的内源性免疫系统，因此无法完全模拟CTLA-4纳米抗体对调节性T细胞（Treg）、树突状细胞等内源性免疫细胞的调节作用，也无法全面评估将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”的能力。在动物模型中观察到的抗肿瘤效果主要反映了CAR-T细胞对FAP+基质细胞的直接杀伤。这一说明体现了研究的严谨性。未来需要在免疫健全的模型中进行更深入的机制探索，并在更大规模的临床试验中验证其疗效。