Hans Clevers 等人于2019年7月在 Cancer Discovery 期刊上发表了题为 “Oral Mucosal Organoids as a Potential Platform for Personalized Cancer Therapy” 的研究。该研究由荷兰 Hubrecht Institute、University Medical Center Utrecht 及 Cold Spring Harbor Laboratory 等多个研究机构合作完成，通讯作者为 Hans Clevers。研究团队成功建立了来源于人口腔黏膜及头颈部鳞状细胞癌（Head and Neck Squamous Cell Carcinoma，HNSCC）的类器官（organoids）长期培养体系，并通过多层次的体外与体内实验证实这些类器官能够重现原发肿瘤的遗传、组织学和功能特征，进而探索了其作为个性化药物筛选平台的潜力。
从学术背景来看，HNSCC 是全球范围内高发的恶性肿瘤，年新发病例超过50万，其治疗难度较大，晚期患者复发率超过50%。长期以来，HNSCC 的体外研究主要依赖二维肿瘤细胞系或原代角质形成细胞培养，但二维细胞系建系成功率低，且无法完整反映肿瘤的异质性和三维结构。类器官技术此前已在结肠、肝、胰、肺等多种上皮组织及相应肿瘤中成功应用，但在口腔黏膜及 HNSCC 中尚缺乏成熟的长期培养方案。该研究的目标是建立正常口腔黏膜和 HNSCC 来源的类器官培养体系，并验证其在个性化治疗中的可行性。
在工作流程方面，研究首先从手术切除的正常口腔黏膜组织中分离上皮层，经胰蛋白酶消化后获得单细胞或小细胞团，将其包埋于基底膜提取物（Basement Membrane Extract，BME）中并在优化培养基中培养。该培养基包含 B27、N-乙酰-L-半胱氨酸、烟酰胺、EGF、FGF2、FGF10、A83-01、CHIR99021、Forskolin、R-spondin 和 Noggin 等成分。正常口腔黏膜类器官在10至14天内可传代，成功率为65%，并可在体外稳定传代超过15代。随后，研究团队以相同或相近的培养条件对 HNSCC 患者手术或活检标本进行处理，成功建立了31例 HNSCC 类器官系，建系成功率约60%。
在类器官的鉴定与表征方面，研究者通过免疫组化（IHC）检测发现正常黏膜类器官外层为 TP63 和 MKI67 阳性的增殖性基底细胞，而内层为 KRT13 阳性的分化角质形成细胞，显示出与来源组织相似的层次结构。通过透射电镜和扫描电镜观察到丰富的张力丝和桥粒结构，说明类器官保留了角质形成细胞的形态学特征。此外，类器官还支持 HSV1 和 HPV16 的感染与复制，表明其可作为口腔黏膜病毒病理研究的体外模型。
在肿瘤类器官的分子特征验证方面，TP53 是突变频率最高的基因，在16例测序类器官系中有11例（69%）存在 TP53 突变。Nutlin-3（一种 MDM2 激动剂）处理实验显示，TP53 野生型正常类器官对 Nutlin-3 敏感，而携带 TP53 突变的肿瘤类器官大都能够继续生长，这与临床 HNSCC 中约75%的 TP53 突变率一致。转录组分析显示正常和肿瘤类器官在 PCA 中明显分离，差异表达基因包括 KLK6、SLCO1B3、HOXC13、CALB1、EHF 和 BCHE 等已知与 HNSCC 相关的标志物。靶向测序和全外显子组测序进一步确认肿瘤类器官中存在 PIK3CA、KRAS、BRAF、CDKN2A、FAT1 等多种与 HNSCC 相关的基因突变。通过对同一患者原发肿瘤组织和正常组织的测序对比，肿瘤类器官中的突变等位基因频率（VAF）较原发肿瘤有所富集，这可能是由于类器官仅含上皮肿瘤细胞而不含间质和免疫细胞。
在染色体不稳定性（Chromosomal Instability，CIN）分析中，研究团队使用 H2B-mNeon 标记的活细胞成像技术观察类器官的细胞分裂过程。结果表明，肿瘤类器官 T1 表现出明显的染色体分离错误，包括后期桥和多极分裂等现象，而匹配的正常类器官 N1 则较少出现这些异常。通过中期染色体铺展分析发现 T1 的染色体数目较 N1 更不稳定，T3 和 T4 甚至出现四倍体核型，提示肿瘤类器官保留了 HNSCC 的染色体不稳定性表型。
在异种移植实验中，将肿瘤类器官皮下注射至免疫缺陷小鼠体内，所有三个测试的肿瘤类器官系均在至少2/3只小鼠中形成肿瘤，而正常类器官未形成肿瘤。组织学分析显示移植瘤表现出与 HNSCC 一致的角化和分层结构，人细胞核染色阳性证明了其人类来源，部分移植瘤中出现三极有丝分裂及核多形性等恶性特征，甚至观察到肌肉侵袭。
在药物筛选方面，研究团队对13个已表征的肿瘤类器官系进行了顺铂、卡铂和西妥昔单抗（cetuximab）等药物的敏感性测试。顺铂和卡铂的 IC50 值在不同类器官系之间存在显著差异，且两者之间存在相关性（Pearson 相关系数 r = 0.64，p < 0.05）。西妥昔单抗的敏感性亦呈现个体间差异，且其敏感性与 EGFR 表达水平无显著相关性，但携带 PIK3CA、KRAS、HRAS 或 BRAF 等下游突变的类器官系普遍对西妥昔单抗耐药。在放疗敏感性测试中，不同类器官系对电离辐射的响应差异明显，且与部分患者的临床放疗反应存在一致性：3例放疗后复发的患者，其对应类器官系在体外均表现出较高的放疗抗性。
在化疗联合放疗的实验中，研究团队将类器官暴露于放疗和顺铂或西妥昔单抗的联合处理。结果显示，联合治疗能够在较低化疗药物浓度下诱导更多细胞死亡，但在校正化疗本身的细胞毒性后，仅顺铂在部分类器官系中表现出真正的放射增敏效应，而西妥昔单抗与放疗之间主要表现为叠加效应而非协同效应。
此外，研究还探索了靶向药物的敏感性。PIK3CA 抑制剂 alpelisib 的测试显示，携带 H1047R 突变的类器官 T9 对 alpelisib 的敏感性高于携带 E545K 突变的类器官 T1 和 T7，但另一 H1047R 突变类器官 T25 的 IC50 值也较高，说明 PIK3CA 突变类型并不能完全预测药物反应。BRAF V600E 突变的类器官 T9 对 vemurafenib 表现出显著敏感性。mTOR 抑制剂 everolimus、FGFR 抑制剂 AZD4547 和 PARP 抑制剂 niraparib 也在不同肿瘤类器官系中显示出差异化的敏感性，其中部分敏感性可从基因突变（如 RET 或 KDR 突变）得到解释，但并非所有情况都能由基因型预测。
该研究的结论是，HNSCC 来源的类器官能够在体外长期扩增并保留原发肿瘤的遗传、组织学和功能特征，同时支持药物筛选和放疗敏感性测试。这种类器官平台有望在未来用于指导 HNSCC 患者的个性化治疗，尤其是在预测化疗、放疗及靶向治疗反应方面具有重要的转化医学价值。研究的亮点在于首次系统性地建立了口腔黏膜和 HNSCC 类器官的培养条件，并证明其可用于病毒感染建模、染色体不稳定性分析、异种移植以及高通量药物筛选。相比于传统二维细胞系，肿瘤类器官平台在保留肿瘤异质性和个体间差异方面具有明显优势，为后续开展前瞻性临床观察研究奠定了基础。