本研究由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）国家癌症研究所（National Cancer Institute）外科肿瘤学项目组的Amir Kaskas、Paul Clavijo、Jay Friedman、Marco Craveiro及Clint T. Allen等人完成，发表于Oral Oncology期刊2024年3月第150卷，文章编号106705。该研究旨在探讨肿瘤进展过程中外周中性粒细胞（neutrophils）是否参与系统性免疫抑制，以及完整手术切除原发肿瘤能否逆转这一抑制状态，从而增强系统性抗肿瘤免疫。

研究的学术背景源于头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）新辅助免疫治疗的临床观察。已有研究表明，新辅助免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）治疗可促进肿瘤特异性T细胞从原发肿瘤进入外周循环，且该效应与改善的无复发生存期（recurrence free survival, RFS）相关。然而，原发肿瘤本身是否通过诱导全身性免疫抑制而影响治疗结局尚不清楚。肿瘤可通过释放细胞因子诱导紧急髓系造血（emergency myelopoiesis），导致髓系细胞尤其是中性粒细胞在外周大量扩增。肿瘤浸润中性粒细胞具有抑制T细胞功能的能力，但外周中性粒细胞是否独立发挥免疫抑制作用、以及手术切除原发肿瘤能否逆转这一系统性免疫抑制，尚缺乏明确的实验证据。基于此，研究者利用与人类HPV无关的化学致癌物诱导的口腔鳞状细胞癌同源小鼠模型——mouse oral cancer-1（MOC1）细胞系，在具有完整免疫功能的C57BL/6小鼠中建立肿瘤，系统研究肿瘤相关系统性中性粒细胞增多症的发生、其免疫抑制功能以及原发肿瘤手术切除的影响。

本研究的工作流程包括多个实验模块。首先，研究者建立了MOC1肿瘤模型，将5×10⁶个MOC1细胞与30% Matrigel混合后皮下注射至野生型（wild-type, WT）或Rag−/−小鼠侧腹。通过比较两组肿瘤生长曲线，确认T细胞免疫对肿瘤生长的限制作用，并通过流式细胞术分析肿瘤微环境中免疫细胞组成。结果显示，在进展性MOC1肿瘤中，Ly6G+中性粒细胞比例随时间增加。第二，为研究外周髓系细胞积累的动态变化，研究者收集了未荷瘤及荷瘤后10、20、28、38天小鼠的骨髓、外周血和脾脏样本，利用流式细胞术定量Ly6G+与Ly6C+细胞在总白细胞中的比例，同时检测血浆中粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的浓度。随后通过胞内流式细胞术确定G-CSF的细胞来源。第三，为评价外周Ly6G+细胞的免疫抑制能力，研究者从荷瘤小鼠脾脏和肿瘤组织中分离Ly6G+细胞，将其与从naïve小鼠脾脏分离并经CFSE标记的T细胞在抗CD3/CD28刺激条件下共培养，通过流式细胞术检测T细胞增殖指数和干扰素γ（interferon-γ, IFN-γ）的产生，以定量免疫抑制程度。第四，为评估原发肿瘤切除对系统性中性粒细胞增多症的影响，研究者在肿瘤接种后第20天对部分小鼠实施完整原发肿瘤手术切除，并以荷瘤未切除小鼠为对照，在术后多个时间点（第7、14、21天等）检测血浆G-CSF浓度及脾脏和外周血Ly6G+细胞比例。第五，为验证系统性抗肿瘤免疫在肿瘤切除后的变化，研究者进行了体内抗原特异性细胞毒性实验和肿瘤再挑战实验。体内细胞毒性实验将来源于naïve小鼠的脾细胞分别标记高浓度和低浓度CFSE，高浓度CFSE细胞负载MOC1肿瘤抗原p15e604–611肽段，低浓度CFSE细胞负载对照OVA257–264肽段，混合后过继转移至naïve、荷瘤或肿瘤切除后14天的小鼠体内，6小时后通过流式细胞术测定两种细胞比例，计算抗原特异性杀伤率。肿瘤再挑战实验则在原发肿瘤切除后14天的小鼠对侧侧腹再次接种MOC1细胞，观察二次挑战肿瘤的成瘤率和生长曲线。为明确效应细胞类型，部分小鼠在肿瘤再挑战前1天开始接受抗CD8或抗CD4抗体耗竭。为判断中性粒细胞耗竭是否可直接增强系统性抗肿瘤免疫，研究者对未切除原发肿瘤的小鼠使用抗Ly6G抗体（1A8）或同型对照抗体，观察原发肿瘤生长及二次挑战肿瘤的生长情况。数据采用GraphPad Prism软件进行统计分析，参数数据两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）及多重比较检验，肿瘤生长曲线采用双因素ANOVA，生存曲线采用log-rank检验，以P<0.05为有统计学意义。

研究的主要结果体现在以下几个方面。第一，MOC1肿瘤在WT小鼠中生长较Rag−/−小鼠缓慢，说明T细胞免疫可部分抑制肿瘤生长，但肿瘤仍能进展，提示存在免疫逃逸机制。肿瘤微环境中Ly6G+中性粒细胞比例随时间上升，与已有研究一致。第二，在肿瘤进展过程中，骨髓、外周血和脾脏中Ly6G+细胞比例显著增加，而Ly6C+单核细胞比例未发生类似变化，说明肿瘤诱导的外周髓系扩增以中性粒细胞为主。同时，血浆G-CSF浓度随肿瘤进展显著升高，GM-CSF和M-CSF无明显变化。胞内流式显示G-CSF主要由肿瘤微环境中的巨噬细胞产生，脾脏巨噬细胞也呈G-CSF阳性，提示肿瘤可能通过巨噬细胞来源的G-CSF驱动中性粒细胞增多。第三，体外免疫抑制实验证实，肿瘤微环境中的Ly6G+细胞能显著抑制T细胞增殖和IFN-γ产生，而荷瘤小鼠脾脏Ly6G+细胞的抑制能力较肿瘤内细胞弱，但仍与或略强于未荷瘤小鼠脾脏Ly6G+细胞，表明外周中性粒细胞在肿瘤存在时获得一定的免疫抑制功能。第四，完整原发肿瘤切除后，血浆G-CSF浓度和脾脏、外周血中Ly6G+细胞比例均逐渐下降，约在术后21天恢复至未荷瘤小鼠水平，提示肿瘤切除可逆转肿瘤驱动的中性粒细胞增多症。第五，体内细胞毒性实验显示，荷瘤小鼠对p15e抗原肽负载细胞的杀伤能力有限，而肿瘤切除后14天的小鼠表现出显著增强的p15e特异性杀伤活性，且naïve小鼠无此杀伤活性，说明系统性抗肿瘤免疫的形成依赖原发肿瘤的存在，而肿瘤切除可进一步释放这一免疫潜能。第六，肿瘤再挑战实验中，原发肿瘤切除后的小鼠二次挑战肿瘤生长显著延迟，且该效应在耗竭CD8+ T细胞后消失，而耗竭CD4+ T细胞不影响该效应，说明肿瘤切除后的系统性抗肿瘤免疫主要由CD8+ T细胞介导。第七，使用1A8抗体耗竭Ly6G+中性粒细胞虽未改变已建立原发肿瘤的生长，但在挑战肿瘤接种前开始耗竭外周中性粒细胞可降低成瘤率（70%对100%）并显著延迟挑战肿瘤生长，进一步支持外周中性粒细胞在系统性免疫抑制中的关键作用。

基于上述结果，作者得出结论：进展性原发肿瘤可通过诱导G-CSF相关的中性粒细胞增多症产生系统性免疫抑制，而完整手术切除原发肿瘤可逆转这一抑制，使系统性肿瘤特异性免疫应答增强。该效应主要由CD8+ T细胞介导。这一发现具有重要意义。在科学层面，该研究首次通过多种独立功能实验直接证明外周中性粒细胞在肿瘤诱导的系统性免疫抑制中具有独立作用，且明确了手术切除原发肿瘤可以解除该抑制。在临床转化层面，该结果提示，新辅助免疫治疗后实施原发肿瘤完整切除，不仅可促进肿瘤特异性T细胞进入外周，还可能因肿瘤切除本身逆转中性粒细胞驱动的免疫抑制而进一步增强系统性抗肿瘤免疫，从而为改善HPV不相关头颈部鳞状细胞癌患者的无复发生存提供机制支持。研究的创新点包括使用功能实验直接评价中性粒细胞的外周免疫抑制能力、将手术切除与免疫状态恢复相关联，以及通过选择性耗竭中性粒细胞验证其在系统性免疫抑制中的因果作用。研究也存在一定局限性，如仅使用一种同源肿瘤模型、该模型无自发远处转移、未深入探讨G-CSF来源巨噬细胞的动态变化等，但总体为理解原发肿瘤切除在免疫治疗策略中的地位提供了重要实验依据。