本研究由中国中国人民解放军总医院（the Chinese PLA General Hospital）皮肤科的易阳与中国人民解放军第309医院（the 309th hospital of Chinese PLA）的骆展鹏（并列第一作者），以及李承新（通讯作者）等合作者共同完成。研究论文于2017年发表在期刊Biomedicine & Pharmacotherapy（第92卷，第744-749页）上。
研究的学术背景 该研究属于皮肤肿瘤学，特别是黑色素瘤（melanoma）分子机制研究领域。黑色素瘤是一种常见且死亡率高的恶性肿瘤。尽管手术对早期患者有效，但晚期患者通常需要化疗或靶向治疗。然而，肿瘤细胞的多药耐药性常导致化疗失败。因此，寻找新的治疗靶点和理解黑色素瘤的恶性行为机制至关重要。
研究背景知识指出，离子通道和转运蛋白在细胞跨膜电位变化中起重要作用，这可能影响肿瘤的形成和转移。电压门控钠通道（Voltage-gated Sodium Channel, VGSC）在某些转移性癌细胞中表达，并能促进其侵袭和转移。其中，钠通道的活性可以诱导细胞钠电流，并通过增加钠/钙交换（Na+/Ca2+ exchange）提高细胞内钙离子浓度，从而影响癌症进展。此外，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）信号通路在细胞生长、增殖、迁移等多种功能中扮演关键角色，并与癌症发展密切相关。
然而，在黑色素瘤细胞中，钠通道、mTOR活性与钙电流三者之间的具体关系尚不清楚。本研究旨在填补这一知识空白。具体目标包括：1. 研究钠通道亚型Nav1.6在人类黑色素瘤细胞和正常表皮黑素细胞中的表达差异。2. 分析钠通道对黑色素瘤细胞钙电流和mTOR活性的影响。3. 探索抑制钠通道或mTOR通路对黑色素瘤细胞侵袭、迁移、增殖和凋亡等恶性表型的影响。
详细研究流程 本研究包含一系列连贯的细胞分子生物学和电生理学实验，主要流程可分为以下几个步骤：
第一步：细胞培养与模型建立 研究使用了三种细胞系作为研究对象：正常人表皮黑素细胞系Pig1，以及两种人恶性黑色素瘤细胞系WM266和WM115。所有细胞系均购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection, ATCC），并按照供应商的说明进行培养和维护。细胞以每孔125，000个的密度接种于6孔板或3.5毫米孔板中。这种设计使得研究人员能够在遗传背景明确的可控条件下，直接比较正常细胞与恶性细胞的差异。
第二步：Nav1.6蛋白表达水平检测（蛋白质印迹法） 为了探究目标钠通道亚型的表达情况，研究人员首先采用蛋白质印迹法（Western blot）检测了Nav1.6蛋白在Pig1、WM266和WM115细胞中的表达水平。具体操作如下：细胞经过处理后，用RIPA裂解缓冲液裂解以提取总蛋白。使用Bio-Rad试剂盒测定蛋白浓度以确保上样量一致。蛋白样品通过SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后转移到PVDF膜上。用10%脱脂牛奶封闭非特异性结合位点后，将膜与一抗（抗Nav1.6抗体，1:1000稀释；抗磷酸化S6激酶抗体，1:1000稀释）在4°C下孵育过夜。随后，与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育60分钟，最后使用ECL化学发光系统进行检测。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参蛋白，用于归一化上样量差异。该方法是分子生物学中检测特定蛋白表达水平的经典且标准的方法。
第三步：电生理活性检测（膜片钳技术） 为了验证蛋白质表达差异是否导致功能改变，并探究离子电流的变化，研究采用了膜片钳技术（patch clamp technique）。这是一种直接测量细胞膜上离子通道电流的尖端技术。具体操作：在处理（用钠通道抑制剂河豚毒素Tetrodotoxin, TTX或mTOR抑制剂雷帕霉素Rapamycin, Rapa处理）后，对细胞进行全细胞膜片钳记录。使用EPC 8膜片钳放大器，在5 kHz采样率下数字化记录数据，并经过1 kHz低通滤波。记录用的玻璃微电极由拉制仪拉制而成，在浴液中电阻为1.5–2.5 MΩ。研究人员分别记录了WM266和WM115细胞的钠电流（Na+ current）和钙电流（Ca2+ current），并与Pig1细胞进行了比较。这部分实验是连接分子表达与细胞表型功能的关键桥梁。
第四步：细胞侵袭和迁移能力检测（Transwell实验） 为了评估黑色素瘤细胞的转移潜能，并测试抑制剂的效应，研究人员进行了细胞侵袭和迁移实验。侵袭实验使用Transwell小室，并在其上预铺30 μL Matrigel基质胶以模拟细胞外基质屏障。将处理后的WM266细胞接种于上室，培养72小时后，用甲醇固定细胞并用结晶紫染色。在显微镜下随机选取10个视野计数穿膜（即发生侵袭）的细胞数。迁移实验的步骤类似，但不预铺Matrigel，仅检测细胞的运动能力。实验均设置三次独立重复，结果以平均值±标准差表示。这是肿瘤学研究中最常用的评估细胞侵袭迁移能力的体外方法之一。
第五步：细胞增殖能力检测 采用多种方法综合评价细胞增殖。首先，使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）进行检测：将细胞接种于96孔板，分别培养24、48、72和96小时后，加入CCK-8试剂，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，吸光度值与活细胞数量成正比。其次，为了进一步确认，使用了Click-iT EdU流式细胞术检测，该方法能特异性标记正在进行DNA合成的增殖期细胞。最后，通过克隆形成实验评估细胞的长期增殖和集落形成能力：将WM266细胞以低密度接种，培养一段时间后形成肉眼可见的克隆，固定染色后计数。这三种方法从短期代谢活性、DNA合成能力和长期克隆形成潜能三个维度全面评估了细胞增殖。
第六步：细胞凋亡检测 为了探究抑制相关通路是否会诱导细胞死亡，研究人员检测了细胞凋亡。主要采用两种方法：1. 膜联蛋白V/碘化丙啶双染色流式细胞术：用胰蛋白酶消化收集处理后的WM266细胞，用PBS洗涤后，重悬于膜联蛋白V结合缓冲液中，并与异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V（Annexin V-FITC）和碘化丙啶（PI）共同孵育。通过流式细胞仪进行分析，区分活细胞（Annexin V-/PI-）、早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）和晚期凋亡/坏死细胞（Annexin V+/PI+）。2. 作为补充和确认，还进行了Hoechst染色，在荧光显微镜下观察细胞核的形态学变化（如核固缩、碎裂），这是凋亡的典型特征。
第七步：凋亡相关蛋白表达检测 为了从分子机制上解释凋亡现象，研究人员再次使用蛋白质印迹法检测了凋亡相关蛋白的表达水平，包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Caspase-3及其切割形式。这有助于将观察到的细胞表型（凋亡）与具体的信号分子变化联系起来。
第八步：数据统计分析 所有实验数据均以平均值±标准差表示。使用SPSS 18.0软件进行统计分析。两组间比较采用非配对学生t检验（unpaired student’s t-test），多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。每个实验均独立重复三次以确保结果的可靠性。
主要研究结果 结果1：Nav1.6在黑色素瘤细胞中过表达，钠电流增强 蛋白质印迹结果显示，与正常黑素细胞Pig1相比，Nav1.6蛋白在黑色素瘤细胞WM266和WM115中的表达水平显著升高，其中WM266细胞的表达量增加了约4倍（***p < 0.001）。相应的，膜片钳记录显示，WM266细胞产生了显著的钠电流（峰值约184 pA，激活时间约1.2 ms），而在Pig1细胞中几乎检测不到明显的钠电流（峰值约36 pA，激活时间约4.8 ms）。这表明Nav1.6不仅在蛋白水平过表达，而且形成了具有功能的通道，导致黑色素瘤细胞膜上钠电流显著增加。
结果2：激活的钠通道通过mTOR信号通路增加钙电流 为了探究钠通道活性与下游信号的关系，研究人员用TTX（抑制钠通道）和Rapa（抑制mTOR）处理WM266细胞，并观察电流变化。发现TTX能显著抑制钠电流，而Rapa对钠电流无直接影响，说明Nav1.6是TTX敏感型的。更重要的是，TTX和Rapa都能显著抑制WM266细胞的钙电流（p < 0.01），且Rapa的抑制作用强于TTX。这表明钠通道的活性通过某种机制影响了钙电流，而mTOR信号通路介导了这一过程。为了直接验证mTOR活性的变化，蛋白质印迹显示，TTX和Rapa处理均能显著降低mTOR下游效应分子磷酸化S6激酶（p-S6）的蛋白水平。这些结果串联起来，形成了一个清晰的逻辑链：抑制钠通道（TTX）或直接抑制mTOR（Rapa）→ mTOR信号通路活性下降（p-S6减少）→ 钙电流降低。从而得出结论：钠通道的激活通过上调mTOR信号通路活性，促进了Na+/Ca2+交换，进而增加了钙电流。**
结果3：抑制mTOR介导的Na+/Ca2+交换可抑制黑色素瘤细胞的侵袭、迁移和增殖 基于上述信号通路的发现，研究人员进一步测试了抑制该通路对细胞恶性表型的影响。Transwell实验表明，与未经处理的对照组WM266细胞相比，TTX和Rapa处理均能显著抑制细胞的侵袭（p < 0.01）和迁移能力（*p < 0.001）。在增殖方面，CCK-8检测、EdU掺入实验和克隆形成实验均得到一致的结果：TTX和Rapa处理能显著抑制WM266细胞的增殖活性，并减少其克隆形成数量。这些结果有力地证明，由钠通道激活、mTOR介导的Na+/Ca2+交换，对于维持黑色素瘤细胞的转移和增殖能力是必需的。
结果4：抑制mTOR介导的Na+/Ca2+交换可促进黑色素瘤细胞凋亡 Hoechst染色显示，TTX和Rapa处理后的细胞出现更多核固缩等凋亡形态。流式细胞术定量分析进一步证实：TTX处理显著促进了WM266细胞的凋亡（总凋亡率增加），而Rapa处理则同时诱导了早期和晚期凋亡。从分子机制上看，蛋白质印迹结果显示，TTX和Rapa处理下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并促进了促凋亡蛋白Caspase-3的切割（激活）。这表明，阻断该信号通路能够通过调节凋亡相关蛋白的表达，最终诱导黑色素瘤细胞发生程序性死亡。
研究的结论与意义 本研究的核心结论是：在黑色素瘤细胞中，Nav1.6钠通道通过激活mTOR信号通路，增强Na+/Ca2+交换，从而提高细胞内钙电流，进而促进细胞的增殖、侵袭和迁移，并抑制细胞凋亡。
其科学价值在于： 1. 机制创新： 首次在黑色素瘤中系统地阐明了Nav1.6钠通道、mTOR信号和钙离子动态三者之间的功能联系，提出了“钠通道-mTOR-Na+/Ca2+交换-钙电流”这一新的信号轴，为理解黑色素瘤的恶性生物学行为提供了新的分子视角。 2. 靶点发现： 将Nav1.6钠通道确立为黑色素瘤的一个潜在治疗靶点。研究表明，使用TTX这类钠通道抑制剂，可以通过干扰上述信号轴，有效抑制肿瘤细胞的多种恶性表型。 3. 治疗策略启示： 研究结果暗示，针对mTOR信号通路的抑制剂（如雷帕霉素及其类似物）可能对具有Nav1.6高表达的黑色素瘤患者有效。同时，也提示联合靶向钠通道和mTOR通路可能是一种有前景的治疗策略。
研究的亮点 1. 研究逻辑严谨，层层递进： 研究从蛋白表达差异（Western blot）入手，到功能验证（膜片钳测电流），再到信号通路探索（检测p-S6），最后延伸到细胞表型（增殖、侵袭、凋亡）和凋亡分子机制，构成了一个完整、自洽的证据链条。 2. 技术手段全面： 结合了分子生物学（Western blot）、尖端电生理学（膜片钳）、细胞功能学（Transwell， CCK-8， EdU， 克隆形成）和细胞死亡检测（流式凋亡， Hoechst染色）等多种技术，从多个角度验证了科学假设。 3. 发现具有潜在转化价值： 不仅揭示了基础生物学机制，更直接指向了新的药物靶点（Nav1.6）和潜在的治疗途径，为后续开发抗黑色素瘤新药奠定了理论基础。
其他有价值的内容 研究在讨论部分简要回顾了黑色素细胞中已知的其他离子通道（如TRPM1， TRPM7等），并将本研究的新发现置于更广阔的背景下，指出离子通道整体作为治疗靶点的潜力。此外，研究得到了国家自然科学基金和北京市自然科学基金的资助，并声明无利益冲突，符合学术规范。