该项研究由来自韩国延世大学的Myeong Joon Kim、Kyungsoo Kim、Sang-Jun Ha等，以及汉阳大学的Je-Min Choi等科研人员共同完成，成果以Article形式发表于2023年的《Nature Immunology》期刊。
本研究隶属于肿瘤免疫学领域，聚焦于肿瘤微环境中调节性T细胞的生物学功能及其调控机制。调节性T细胞在肿瘤微环境中发挥强大的免疫抑制作用，是限制抗肿瘤免疫应答的关键因素。程序性死亡受体1是重要的免疫检查点分子，在肿瘤浸润T细胞上高表达，其阻断疗法在多种癌症中展现出显著疗效。然而，PD-1在肿瘤浸润Treg细胞上的具体功能尚存争议：一些研究表明PD-1能维持Treg细胞的稳态和功能，而另一些研究则认为PD-1会抑制Treg细胞的抑制活性。这种矛盾使得深入探究PD-1在Treg细胞，特别是在肿瘤微环境这一特定场景下的作用机制变得尤为迫切。本研究的核心目标在于，利用条件性基因敲除小鼠模型和单细胞分析技术，阐明PD-1信号如何调控肿瘤浸润Treg细胞的谱系稳定性、代谢适应度及其抑制功能，从而为优化癌症免疫治疗策略提供新的见解。
研究的工作流程系统而深入，主要包含以下几个关键环节。首先，研究者通过流式细胞术分析了多种小鼠肿瘤模型中T细胞亚群上免疫检查点受体的表达谱，发现在肿瘤微环境中，Treg细胞表达PD-1、Tim-3、TIGIT和LAG-3的水平普遍高于CD8+ T细胞和常规CD4+ T细胞，这提示PD-1在Treg细胞上的功能可能至关重要。接着，为了特异性地研究PD-1在Treg细胞中的作用，研究团队构建并使用了条件性敲除小鼠模型。核心模型为Pdcd1fl/flFoxp3eGFP-Cre-ERT2小鼠，通过他莫昔芬诱导，可以特异性地在表达Foxp3的Treg细胞中删除PD-1基因，而在其他T细胞中保留，从而实现在同一小鼠体内同时存在PD-1表达型与PD-1缺失型Treg细胞，有效控制了微环境差异带来的干扰。研究还包括了Pdcd1fl/flFoxp3eGFP-Cre-ERT2Rosa26tdTomato报告小鼠，用于追踪即使丢失Foxp3表达的“前Treg细胞”，以评估谱系稳定性。
在肿瘤进展模型中，研究者在给予他莫昔芬诱导PD-1条件性敲除后，给小鼠接种TC-1肺癌细胞或B16F10黑色素瘤细胞，并持续监测肿瘤生长、小鼠生存期以及肿瘤和脾脏中免疫细胞的数量、表型和功能。样本量方面，每个实验组通常包含5至18只小鼠，具体数量因实验设计而异，并在图注中明确标注。数据分析主要依赖于流式细胞术，检测指标涵盖细胞凋亡、增殖、关键表面分子及转录因子的表达水平。此外，研究还设计了体外共培养实验，从肿瘤中分选PD-1+和PD-1-的Treg细胞，评估它们对CD8+ T细胞增殖和功能的抑制能力。为了探究PD-1抗体疗法的机制，研究对野生型和条件敲除小鼠进行了PD-1抗体治疗，并分析其对肿瘤浸润淋巴细胞的影响。
本研究的亮点在于引入了单细胞测序技术以揭示分子机制。研究者对PD-1抗体或同型对照处理后的Pdcd1fl/flFoxp3eGFP-Cre-ERT2(+/−)小鼠肿瘤中的CD4+ T细胞进行了单细胞RNA测序和单细胞TCR测序。该技术无需预先分选，即可在单细胞分辨率下同时获得数千个细胞的转录组信息和TCR克隆型信息。数据分析流程包括：使用Uniform Manifold Approximation and Projection进行降维和细胞亚群鉴定；通过基因集变异分析比较不同亚群在特定生物学通路（如增殖、抑制、代谢）上的活性差异；分析TCR克隆型的分布，计算Gini指数以评估克隆扩增的不均衡性；以及进行基因集富集分析，寻找在PD-1表达型和缺失型Treg细胞间差异富集的通路。
研究取得了一系列环环相扣的重要结果。表型分析显示，在Treg细胞中条件性敲除PD-1能够显著延迟TC-1和B16F10肿瘤的生长，并提高荷瘤小鼠的生存率。这种抗肿瘤效应伴随着肿瘤内Treg细胞池的减少，以及CD8+ T细胞与Treg细胞比值的升高。深入机制研究发现，肿瘤浸润PD-1缺失型Treg细胞表现出增殖能力下降、凋亡增加、以及关键稳定性分子如Foxp3、CTLA-4、CD25等的表达下调。特别重要的是，在同一只Pdcd1fl/flFoxp3eGFP-Cre-ERT2(+/−)小鼠的肿瘤微环境中，PD-1缺失型Treg细胞与PD-1表达型Treg细胞直接比较时，前者同样表现出更高的不稳定性、更低的抑制相关分子表达和更弱的体外抑制能力。这一“细胞自主性”实验设计有力地证明了PD-1对Treg细胞稳定性的维持作用是其内在属性，而非由不同的微环境所导致。谱系追踪实验进一步证实，PD-1缺失会导致更多肿瘤浸润Treg细胞丢失Foxp3表达，转化为“前Treg细胞”，明确了PD-1在维持Treg细胞谱系身份中的关键作用。
在治疗干预方面，研究发现PD-1抗体治疗能够有效延缓野生型小鼠的肿瘤进展，但在Treg细胞特异性PD-1敲除的小鼠中，其疗效大打折扣。在TC-1模型中，PD-1抗体的主要作用机制是减少肿瘤内Treg细胞的数量并降低其Foxp3表达，而非直接“拯救”耗竭的CD8+ T细胞的功能。这提示在特定肿瘤模型中，PD-1抗体疗法的疗效可能部分源于其对肿瘤内Treg细胞稳定性的削弱。
单细胞测序结果为上述表型提供了深刻的分子解释。转录组分析显示，肿瘤内PD-1表达型Treg细胞与PD-1缺失型Treg细胞具有截然不同的转录谱。基因集分析表明，PD-1缺失型Treg细胞中与增殖、抑制功能相关的通路活性显著降低。TCR克隆分析揭示了一个关键现象：肿瘤内PD-1表达型Treg细胞存在明显的克隆扩增，而PD-1缺失型Treg细胞则主要为独特克隆型，其克隆多样性指数显著更高。这表明PD-1信号对于驱动肿瘤内Treg细胞的优势克隆扩增至关重要。最引人注目的发现集中在代谢层面。GSVA和GSEA分析均一致显示，与脂质代谢、PPAR-β信号通路靶基因以及氧化磷酸化相关的基因集在PD-1表达型Treg细胞中显著富集。同时，实验验证显示PD-1缺失型肿瘤浸润Treg细胞的脂质摄取能力和线粒体质量均下降。这些结果共同表明，PD-1信号通过促进脂质代谢和线粒体功能，为Treg细胞在营养竞争激烈、乳酸富集的肿瘤微环境中提供了关键的代谢适应度，从而保障其存活、增殖和功能维持。
本研究得出的核心结论是：在肿瘤微环境中，Treg细胞上表达的PD-1并非抑制其功能的“刹车”，反而是维持其谱系稳定性、代谢适应度和免疫抑制能力的关键“稳定器”。PD-1信号通过驱动脂质代谢相关通路，促进Treg细胞的克隆扩增和在恶劣微环境中的存活，从而稳固其在肿瘤内的抑制性生态位。因此，靶向Treg细胞的PD-1信号（无论是通过基因敲除还是抗体阻断），能够破坏这种稳定性，削弱Treg细胞的抑制功能，最终增强机体的抗肿瘤免疫应答。该研究具有重要的科学价值和应用价值。在科学上，它系统地澄清了PD-1在肿瘤浸润Treg细胞中功能的长期争议，并首次将PD-1信号与Treg细胞的代谢重编程和克隆动态直接联系起来，深化了对肿瘤免疫微环境中免疫细胞代谢适应性的理解。在应用上，该研究为癌症免疫治疗提供了新的视角：评估患者肿瘤内Treg细胞的PD-1表达水平和代谢状态，可能成为预测PD-1/PD-L1抑制剂疗效的潜在生物标志物；同时，该研究也提示，联合靶向Treg细胞代谢（如脂质代谢）与PD-1阻断，或许能产生协同抗肿瘤效应，为开发新的联合治疗策略提供了理论基础。
本研究的亮点在于：一、重要的科学发现：明确揭示了PD-1在肿瘤微环境中对Treg细胞功能起“正向”支持作用，挑战了部分传统认知。二、新颖的研究方法：巧妙运用可在同一微环境中比较PD-1+/- Treg细胞的杂合子小鼠模型，以及用于谱系追踪的报告小鼠模型，结论更具说服力。三、先进的整合分析：将经典免疫表型分析与前沿的单细胞多组学测序技术相结合，从细胞、克隆到分子层面，全方位、多层次地阐明了作用机制，特别是将PD-1功能与克隆扩增和代谢重编程直接关联。四、明确的临床启示：对PD-1抗体疗法的机制提出了补充解释，强调了其对肿瘤内Treg细胞池的影响，并指出了基于Treg细胞状态进行患者分层和联合治疗的潜力。