本研究的核心作者为 Adam P. Croft 和 Christopher D. Buckley，共同作者包括来自多个国际知名研究机构的学者。主要参与机构包括：英国伯明翰大学炎症与衰老研究所风湿病学研究组、英国牛津大学肯尼迪风湿病学研究所、美国西北大学范伯格医学院、美国冷泉港实验室、美国哈佛医学院布莱根妇女医院等。
这项研究成果以题为 《Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis》 的论文形式，于 2019年6月1日 发表在顶级学术期刊 《Nature》 上（第570卷，第7760期，第246-251页）。文章的最终编辑版本在线发表于2019年11月29日。
科学领域： 本研究属于风湿免疫病学、炎症生物学和细胞免疫学交叉领域，聚焦于关节炎的发病机制，特别是组织驻留间充质细胞（成纤维细胞）的功能异质性。
研究背景与动机： 在免疫介导的炎症性疾病中，淋巴细胞亚群具有非重叠的效应功能这一发现，对靶向治疗的发展起到了关键作用。然而，在类风湿关节炎等疾病中，组织驱动的过程（如慢性炎症和进行性骨与软骨损伤）背后，是否存在同样具有非重叠功能的成纤维细胞亚群，尚不清楚。滑膜成纤维细胞已被公认为RA病理的关键参与者，既能促进关节破坏，也能驱动炎症。成纤维细胞活化蛋白α的表达在RA患者滑膜组织中升高，提示其可能与致病性成纤维细胞表型相关。因此，深入解析滑膜成纤维细胞的异质性，识别并功能验证其不同亚群，对于理解关节炎病理和开发精准治疗策略至关重要。
研究目的： 本研究旨在：1）识别并描述在关节炎中介导炎症或组织损伤的、功能各异的成纤维细胞亚群；2）阐明这些亚群在解剖学上的分布、转录组特征和效应功能；3）通过体内外实验验证其非重叠的致病作用；4）探讨这些发现在人类疾病中的相关性及其对细胞靶向治疗的启示。
本研究是一个综合性、多层次的研究项目，结合了人类样本分析、小鼠疾病模型、单细胞测序、细胞谱系追踪、细胞过继转移等多种技术手段。工作流程主要包含以下核心步骤：
第一步：人类疾病样本的表征与分析 * 研究对象： 人类滑膜组织和原代培养的滑膜成纤维细胞。样本来源包括：符合分类标准的类风湿关节炎（RA）患者、炎症已缓解的患者、骨关节炎（OA）患者以及关节影像学正常（作为对照）的个体。所有RA患者入组时未使用过改善病情抗风湿药或皮质类固醇。 * 处理方法与实验： 1. 组织学与免疫荧光： 对滑膜组织进行冷冻切片或石蜡包埋切片。使用针对FAPα、PDPN（Podoplanin）和Thy1（CD90）的抗体进行免疫组化和多重免疫荧光染色，通过共聚焦显微镜和全玻片扫描仪成像，量化蛋白表达与定位。PDPN和Thy1用于区分滑膜衬里下层（Thy1+）和衬里层（Thy1-）成纤维细胞。 2. 质谱流式细胞术（CyTOF）： 将解离的人类滑膜单细胞悬液用金属标记的抗体（CD45, PDPN, FAP, Thy1）染色，在Helios质谱流式细胞仪上进行分析，以高维度表征细胞表面标志物的共表达情况。 3. 细胞培养与分子检测： 从滑膜组织中分离并培养成纤维细胞至第3或4代，用于体外实验。通过实时定量PCR检测FAP等基因的mRNA表达水平。
第二步：小鼠关节炎模型中FAPα+细胞的功能研究 * 研究对象： 使用FAPα-白喉毒素受体-荧光素酶（FAPα-DTR-Luc）转基因报告小鼠。关节炎模型采用两种：血清转移诱导性关节炎（STIA，分为可消退型和持续型）和胶原诱导性关节炎（CIA）。 * 处理方法与实验： 1. 体内成像与表征： 在STIA过程中，通过腹腔注射荧光素底物，利用IVIS系统进行活体生物发光成像，动态监测关节内FAPα表达，并与关节肿胀程度关联。 2. 细胞删除实验： 在关节炎不同阶段（诱导前、急性期、慢性期）向FAPα-DTR小鼠腹腔注射白喉毒素（DTx），选择性删除表达FAPα的细胞。评估其对关节肿胀、炎症细胞浸润、骨侵蚀、软骨破坏、破骨细胞数量等病理指标的影响。为排除全身性影响，还进行了DTx关节腔内局部注射。 3. 流式细胞术分析： 消化收集小鼠发炎关节的滑膜组织，制成单细胞悬液，通过多色流式细胞术全面分析各类细胞（包括不同表型的成纤维细胞、免疫细胞）的数量、增殖（Ki67, BrdU标记）和表型变化。 4. 组织病理学与Micro-CT分析： 对关节进行H&E、番红O（软骨）、Cathepsin K（破骨细胞）等染色，进行组织形态计量学评分。使用Micro-CT扫描评估骨侵蚀和新骨形成的三维结构变化。
第三步：单细胞转录组学解析成纤维细胞异质性 * 研究对象： 从小鼠STIA第9天的发炎关节滑膜中，分选出CD45-的非造血细胞。 * 处理方法与实验： 1. 单细胞捕获与测序： 使用10x Genomics Chromium系统对分选细胞进行单细胞捕获，构建3‘端RNA测序文库，在Illumina HiSeq 4000平台上进行测序。 2. 数据分析流程（创新性方法）： 使用10x Genomics的Cell Ranger软件进行序列比对和定量。下游分析主要使用Seurat R软件包。分析流程包括：质量控制（去除线粒体基因比例过高或检测基因数过少的细胞）、数据归一化、回归去除UMI总数和线粒体基因占比的影响、主成分分析、基于图论的Louvain算法聚类（分辨率设置为0.4）、t-SNE降维可视化。使用Wilcoxon检验鉴定各簇的保守标记基因。通过Gene Ontology（GO）富集分析推断各亚群的功能倾向。使用扩散映射（Diffusion Map） 和伪时间轨迹分析工具Slingshot来推断不同成纤维细胞亚群之间的潜在发育关系。 3. 跨物种比对： 为了验证小鼠模型中发现的相关性，研究人员重新分析了已发表的来自20名RA患者的滑膜组织单细胞RNA测序数据集（Cel-seq2技术），使用相同的Seurat分析流程识别人类滑膜成纤维细胞亚群。通过比对小鼠和人之间同源的（一对一的）簇标记基因，寻找功能保守的成纤维细胞亚群。
第四步：功能验证：成纤维细胞亚群的分离、表征与过继转移 * 研究对象： 从STIA第9天的小鼠滑膜中，根据PDPN、FAPα和Thy1的表达，通过流式细胞分选技术纯化出四个细胞群体：PDPN+FAPα+Thy1-、PDPN+FAPα+Thy1+、PDPN+FAPα-Thy1-、PDPN+FAPα-Thy1+。 * 处理方法与实验： 1. 超低输入RNA测序： 对分选纯化的细胞群体进行超低输入量RNA测序（SMART-seq v4），通过主成分分析和差异表达基因分析，在转录组水平确认Thy1+和Thy1-细胞的截然不同。 2. 体外功能实验： 评估不同亚群分泌炎性细胞因子/趋化因子（Luminex多因子检测）、表达RANKL/OPG（ELISA、流式细胞术）以及诱导破骨细胞分化和骨吸收的能力（与骨髓前体细胞共培养，测定破骨细胞数量和羟基磷灰石基质吸收面积）。 3. 体内过继转移实验（关键验证步骤）： 将分选纯化的PDPN+FAPα+Thy1-或PDPN+FAPα+Thy1+细胞（50万个），在STIA或CIA模型小鼠关节炎发作期，注射到其发炎的踝关节腔内。监测其对关节炎症（肿胀度、白细胞浸润）、骨与软骨破坏（Micro-CT、组织学）的独立影响。通过使用表达红色荧光蛋白（tdTomato）的报告小鼠来源的细胞进行注射，并在注射后不同时间点通过流式细胞术和共聚焦显微镜追踪移植细胞的定植、存活和表型维持情况。
结果一：FAPα+成纤维细胞在关节炎关节中扩增并具有致病性。 在人类RA滑膜中，FAPα蛋白和mRNA水平均显著高于炎症缓解的患者或OA患者。FAPα与PDPN共表达，分布于滑膜衬里层和下层的成纤维细胞中。在小鼠STIA模型中，关节内FAPα表达（生物发光信号）随关节炎发展而升高，并与关节肿胀程度正相关。FAPα表达局限于CD45-的间充质细胞，在炎症期间其数量显著增加，炎症消退后恢复基线。删除FAPα+细胞（无论是全身性还是关节局部）能显著减轻STIA（包括可消退型和持续型）的关节肿胀、加速炎症消退，并大幅减少骨侵蚀、软骨破坏、破骨细胞形成和炎性介质（细胞因子、趋化因子、MMPs、RANKL）的产生。这些结果确立了FAPα+成纤维细胞作为关节炎炎症和损伤的关键驱动者。
结果二：单细胞转录组学揭示五个功能特化的滑膜成纤维细胞亚群。 对小鼠发炎滑膜CD45-细胞进行单细胞RNA测序，共分析2814个细胞。在成纤维细胞（共1725个细胞）中，无监督聚类分析揭示了五个不同的亚群（F1-F5）。GO富集分析显示它们功能各异：F1（表达Col11a1等）与骨、软骨和细胞外基质形成相关；F2高表达炎性基因，参与“细胞因子产生”和“白细胞趋化调节”；F3（表达Cd34等）与“补体激活”和“血管生成”相关；F4是活跃细胞周期群体；F5则独特地富集“酸分泌”和“氢离子转运”相关基因。关键发现是：虽然PDPN和Fap在所有亚群均有表达，但Thy1选择性地表达于F1-F4亚群，而不表达于F5亚群。结合解剖学知识，这提示F5对应Thy1-的衬里层成纤维细胞，而F1-F4对应Thy1+的衬里下层成纤维细胞。扩散映射和伪时间轨迹分析支持了细胞亚群间的潜在关系。跨物种比对在人类RA滑膜成纤维细胞中识别出五个同源亚群，其中三个（小鼠F5-人F4衬里层成纤维细胞；小鼠F3-人F5 CD34+衬里下层成纤维细胞；小鼠F1-人F2 Col11a1+衬里下层成纤维细胞）具有保守的基因表达特征。
结果三：Thy1+和Thy1-成纤维细胞亚群具有截然不同的分子与功能特征。 对分选细胞群体的转录组分析证实，Thy1是决定滑膜成纤维细胞转录谱（即解剖位置）的最主要因素。PDPN+FAPα+Thy1+细胞表现出免疫效应特征，高表达多种趋化因子（如CCL2, CCL5）和细胞因子（如IL6, IL33）。而PDPN+FAPα+Thy1-细胞则高表达CCL9、RANKL（Tnfsf11）、以及MMP3、MMP9、MMP13等基质金属蛋白酶。蛋白水平验证显示，Thy1-细胞表面表达并分泌更高水平的RANKL，其RANKL/OPG比值显著更高，并且在体外能更有效地诱导破骨细胞分化和骨吸收。
结果四：体内过继转移实验证实成纤维细胞亚群的非重叠致病功能。 这是本研究的核心功能验证。将PDPN+FAPα+Thy1+细胞注射到发炎关节，导致了更严重和持久的关节肿胀，伴随大量白细胞（中性粒细胞、巨噬细胞、效应CD4+ T细胞）浸润，但对骨和软骨的破坏影响很小。相反，注射PDPN+FAPα+Thy1-细胞对关节炎症的严重程度和进程几乎没有影响，但却显著增加了破骨细胞活性，并导致了更严重的骨侵蚀和软骨破坏。移植的细胞能够在滑膜内定植至少14天，并维持其原始的Thy1表型。这一结果直接证明，在病理条件下，Thy1+细胞扮演免疫效应角色，通过产生特定的趋化因子和细胞因子来维持炎症；而Thy1-细胞则是骨效应细胞，专门介导关节的结构性损伤。
结果五：人类疾病验证。 在人类样本中，与以软骨损伤为主的OA相比，在持续性炎症的RA患者滑膜中，PDPN+FAPα+Thy1+免疫效应成纤维细胞亚群显著扩增。该亚群的数量与系统性炎症指标（血沉ESR）和滑膜组织炎症评分（Krenn评分）均呈正相关，进一步支持了该亚群在人类RA炎症驱动中的关键作用。
结论： 本研究首次在关节炎中系统性地识别、描述并功能验证了在解剖学上离散、功能上非重叠的致病性成纤维细胞亚群。具体而言，位于滑膜衬里下层的FAPα+Thy1+ 免疫效应成纤维细胞主要负责驱动和维持炎症；而位于滑膜衬里层的FAPα+Thy1- 破坏性成纤维细胞则专门负责介导骨和软骨的损伤。这两个亚群共同构成了关节炎病理的核心细胞基础。
科学价值： 1. 深化了对关节炎发病机制的理解： 将成纤维细胞从“同质的病理贡献者”提升为“功能特化的效应细胞亚群”，为理解组织驱动性炎症和损伤提供了新的细胞生物学框架。 2. 揭示了治疗新靶点： 研究明确指出，针对不同成纤维细胞亚群进行选择性干预（删除或调节），可能能够分别控制炎症或阻止关节破坏，为开发更精准、副作用更小的疗法提供了直接的理论依据。 3. 提供了强大的研究方法范例： 成功整合了单细胞多组学、条件性基因删除、谱系追踪和功能性过继转移等多种前沿技术，为研究其他复杂疾病中组织驻留细胞的异质性提供了可借鉴的范式。
应用价值： 这项研究为开发针对特定间充质细胞亚群的细胞疗法或靶向药物奠定了基础。例如，在需要抑制炎症而不影响组织修复的场合，或需要保护骨软骨而不干扰免疫监视的场合，可以设计特异性靶向Thy1+或Thy1-成纤维细胞的策略。此外，FAPα+Thy1+细胞作为炎症生物标志物，也可能用于疾病活动度评估或治疗反应监测。