学术研究报告：核酸适配体作为分子栓系剂诱导PrP^C聚集和降解以抑制黑色素瘤增殖

一、研究团队与发表信息
本研究由Tiantian Xie、Yibin Zhang等共同完成，通讯作者为Wencan Wu、Mao Ye和Weihong Tan。研究团队来自多个机构，包括湖南大学分子科学与生物医学实验室（MBL）、中南大学湘雅医院病理科、温州医科大学眼视光学院等。研究成果发表于*Angewandte Chemie International Edition*（2025年，DOI: 10.1002/anie.202425051）。

二、学术背景
黑色素瘤（melanoma）是最具侵袭性的皮肤恶性肿瘤，其治疗面临巨大挑战。前期研究发现，细胞型朊蛋白（cellular prion protein, PrP^C）在黑色素瘤中过度表达，并通过激活Akt-HSP27信号通路、促进IGF-1R泛素化等机制驱动肿瘤进展。然而，靶向PrP^C的治疗策略尚未成熟。

核酸适配体（aptamer）是一类能特异性结合靶标分子的单链寡核苷酸，具有高亲和力、低免疫原性和易修饰等优势。近年来，适配体在靶向蛋白降解（targeted protein degradation, TPD）领域展现出潜力，但如何利用适配体调控膜蛋白（如PrP^C）的降解仍待探索。本研究旨在开发一种基于适配体的分子栓系剂（molecular tethering agent），通过诱导PrP^C聚集和降解抑制黑色素瘤增殖。

三、研究流程与方法
1. 适配体筛选与优化
- 细胞-SELEX筛选：以黑色素瘤细胞A875为阳性靶标，人永生化角质形成细胞HaCaT为阴性对照，通过流式细胞术富集特异性结合的ssDNA序列。经过8轮筛选后，第8轮富集库的荧光信号显著增强（图1b）。
- 内化-SELEX筛选：通过高盐溶液、胰蛋白酶和核酸酶处理去除细胞表面结合的ssDNA，进一步富集内化序列。第13轮筛选后获得高内化能力的候选序列（图1c）。
- 序列优化：从高通量测序结果中选出3个高评分家族的代表序列（TT-1、TT-6、TT-15），其中TT-1因结合特异性和内化能力最优被选为后续研究对象。通过截断实验，确定TT-1的21-59碱基区域（命名为TT-1E）为功能核心（图2a-b），其解离常数（Kd）为86.29 ± 16.79 nM（图2c）。

1. 靶标鉴定与机制验证

   • 靶标鉴定：通过Pull-down联合质谱分析，发现TT-1E特异性结合35 kDa的蛋白条带，经LC-MS/MS鉴定为糖基化PrP^C（图3c-e）。竞争实验证实TT-1E与PrP^C的八肽重复区域（octapeptide repeat region）结合（图3h）。
     
   • 糖基化依赖性：PNGase F去糖基化处理后，TT-1E与黑色素瘤细胞的结合能力消失（图4f-h），表明其仅识别糖基化PrP^C。
     

2. 分子栓系剂TTE-TTE的设计与功能验证

   • 构建策略：在TT-1E的3’端添加30个互补碱基和4个T接头，形成双链结构TTE-TTE（图5a-b）。该结构稳定性高，血清半衰期达241.4分钟，且Kd值降至21.20 ± 4.15 nM（图5c）。
     
   • 诱导PrP^C聚集与降解：TTE-TTE通过多价交联作用诱导PrP^C在细胞膜表面聚集（图6a-b），随后通过溶酶体途径降解（图6g-h）。Western blot显示PrP^C水平随TTE-TTE浓度和时间依赖性下降（图6c-f），且Akt磷酸化水平降低（图6j）。
     

3. 体内外抗肿瘤效果

   • 体外实验：TTE-TTE显著抑制黑色素瘤细胞A875和A375的增殖（图7a），但对HaCaT细胞无影响。
     
   • 体内实验：在A375异种移植小鼠模型中，瘤内注射TTE-TTE显著减小肿瘤体积（图7c-f），且免疫组化显示肿瘤组织中PrP^C和Ki-67表达下调（图7h）。
     

四、主要结果与逻辑链条
1. 适配体筛选：通过两步SELEX获得高特异性适配体TT-1E，其结合靶点为糖基化PrP^C。
2. 机制解析：TTE-TTE通过诱导PrP^C聚集促进其内化和溶酶体降解，进而抑制Akt通路激活。
3. 治疗验证：体内外实验证实TTE-TTE选择性抑制黑色素瘤生长，且无显著毒性。

五、研究意义与价值
1. 科学价值：首次证明适配体可作为分子栓系剂调控膜蛋白降解，为靶向蛋白降解提供了新范式。
2. 应用价值：TTE-TTE为黑色素瘤治疗提供了新策略，并可能拓展至其他PrP^C相关疾病（如朊病毒病）。

六、研究亮点
1. 方法创新：结合细胞-SELEX与内化-SELEX筛选出兼具结合和内化能力的适配体。
2. 靶点特殊性：TT-1E特异性识别糖基化PrP^C，避免对正常细胞的脱靶效应。
3. 转化潜力：TTE-TTE的体内稳定性和靶向性为其临床转化奠定基础。

七、其他有价值内容
研究还发现黑色素瘤细胞中PrP^C糖基化水平显著高于正常细胞（图4e），提示糖基化修饰可能作为肿瘤治疗的潜在靶点。此外，TTE-TTE的药代动力学参数（如清除率CL = 2.33 ± 0.10 mL/min/kg）优于既往报道的PEG化适配体，凸显其优化设计的合理性。