本研究由青岛大学附属医院泌尿外科与Andrology重点实验室、医学研究中心的梁晔、王永华（共同第一作者）、王丽萍、梁志娟、李丹、徐晓宇、陈元斌，青岛大学附属医院泌尿外科的杨学成，以及Åbo Akademi大学药物科学实验室与图尔库生物科学中心的张宏博，和青岛大学附属医院的牛海涛（通讯作者）共同完成。该研究发表于期刊《Bioactive Materials》2021年第6卷。

学术背景 膀胱癌是全球范围内令人关注的恶性肿瘤之一，其治疗缺乏有效的靶向疗法。尽管经尿道切除术和膀胱内辅助疗法是常规手段，但非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）仍有较高复发风险，而肌层浸润性膀胱癌（MIBC）则死亡率高。当前化疗方案响应率有限且存在毒副作用，而膀胱内灌注给药因药物驻留时间短、难以穿透肌层，对MIBC和转移性肿瘤效果不佳。因此，开发具有肿瘤特异性定位和低毒副作用的全身给药系统势在必行。

基因治疗是肿瘤靶向治疗的潜在途径。Bcl2是一种细胞存活蛋白，其过表达与膀胱癌的发生、进展和治疗抵抗密切相关。利用小干扰RNA（siRNA）进行RNA干扰（RNAi）可以实现基因特异性敲低，但siRNA在体内易降解且难以特异性地在肿瘤部位累积。因此，需要一种安全、有效且具有靶向性的递送系统。

壳聚糖（CS）作为一种天然阳离子多糖，具有良好的生物相容性、可降解性以及负载基因药物的能力。然而，壳聚糖纳米颗粒本身对肿瘤细胞缺乏靶向性。透明质酸（HA）是一种天然聚合物，其受体CD44在多种肿瘤细胞（包括膀胱癌细胞）表面过表达。本研究旨在利用CD44的靶向性，开发一种基于天然大分子的靶向基因递送系统。核心思路是：制备透明质酸二醛（HAD），通过其醛基与壳聚糖的氨基共价结合，将HA修饰到壳聚糖纳米颗粒表面，从而构建能够靶向CD44受体的siRNA递送系统（siRNA@CS-HAD NPs），用于递送靶向Bcl2癌基因的siRNA，以实现对膀胱癌的有效治疗。

研究详细流程 本研究流程可概括为七个主要部分：1) CD44表达验证与有效干扰序列筛选；2) 靶向纳米颗粒载体材料的合成与制备；3) 纳米颗粒的表征；4) 体外细胞实验评估靶向递送与干扰效果；5) 血液相容性评估；6) 体内动物模型抗肿瘤效果与靶向性验证；7) 数据分析。

第一部分：CD44表达验证与有效干扰序列筛选 * 研究对象与样本量：从10例高级别膀胱癌并接受膀胱全切术的患者中获取配对的癌组织和正常组织。使用膀胱癌细胞系T24、5637以及正常输尿管上皮细胞系SV-HUC-1。 * 实验方法： * 免疫组织化学：使用CD44抗体检测膀胱癌组织和正常组织中CD44的蛋白表达水平。 * 蛋白质印迹：检测不同细胞系中CD44和Bcl2的蛋白表达水平。 * siRNA设计与筛选：针对Bcl2基因的不同位点（528， 928， 1014）设计了三条siRNA序列。使用HiPerFect转染试剂将siRNA转染至T24细胞，转染两次。通过定量实时PCR（qPCR）检测转染24小时后Bcl2的mRNA水平，通过蛋白质印迹检测转染48小时后Bcl2的蛋白水平，以筛选干扰效率最高的序列。

第二部分：HAD合成与靶向纳米颗粒制备 * 材料与方法： * HAD合成（创新方法）：在乙醇-水混合相中，用高碘酸钠氧化透明质酸（HA），通过控制高碘酸钠与HA的摩尔比（1:2， 1:4， 1:8）制备了具有不同二醛基团数量的HAD（命名为HAD-1， HAD-2， HAD-3）。反应在避光、室温下搅拌6小时，产物在乙醇中沉淀、洗涤并真空干燥。该方法简化了传统水相反应后需要冻干的繁琐步骤。使用菲林试剂验证醛基存在，并通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）确认特征峰。 * 纳米颗粒制备：采用离子凝胶法。将壳聚糖溶于醋酸缓冲液，三聚磷酸钠（TPP）和HAD溶于双蒸水。在超声条件下，将TPP溶液滴加至壳聚糖溶液中形成空白壳聚糖纳米颗粒（CS NPs）。将筛选出的高效Bcl2-siRNA（或Cy3标记的siRNA）与TPP混合后，再滴加至壳聚糖溶液中，形成siRNA负载的壳聚糖纳米颗粒（siRNA@CS NPs）。最后，将CS NPs或siRNA@CS NPs与HAD溶液混合超声，通过醛基与氨基的共价结合，制备空白靶向纳米颗粒（CS-HAD NPs）或siRNA负载的靶向纳米颗粒（siRNA@CS-HAD NPs）。所有纳米颗粒在4°C下透析过夜。

第三部分：纳米颗粒表征 * 实验方法： * 理化性质：使用动态光散射仪测量纳米颗粒的粒径、多分散指数（PDI）和Zeta电位；使用扫描电子显微镜观察形貌。 * 稳定性：在PBS缓冲液中监测siRNA@CS-HAD NPs和siRNA@CS NPs在6天内的粒径、PDI和Zeta电位变化。 * siRNA负载效率：通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测不同siRNA投入量下纳米颗粒的上清液中游离siRNA含量，计算包封率。 * 热重分析：通过热重分析比较CS-HAD NPs和CS NPs的重量损失差异，以确认HA的成功修饰。 * 细胞毒性：根据ISO标准，使用MTT法检测CS NPs和CS-HAD NPs对小鼠成纤维细胞L929的细胞毒性，评估不同浓度（5-80 μg）和作用时间（24， 48， 96小时）下的相对生长率。同时检测不同纳米颗粒（CS NPs， CS-HAD NPs， siRNA@CS NPs， siRNA@CS-HAD NPs）对膀胱癌T24细胞活力的影响。

第四部分：体外细胞实验评估靶向递送与干扰效果 * 研究对象：膀胱癌细胞系T24（CD44高表达）。 * 实验方法： * 细胞摄取与干扰效率：用负载Cy3-siRNA的CS-HAD NPs处理T24细胞，以商业转染试剂HiPerFect为阳性对照，通过荧光显微镜观察细胞摄取，流式细胞术定量转染效率。通过qPCR和蛋白质印迹检测不同时间点Bcl2的mRNA和蛋白水平。 * CD44受体激活与分布：通过蛋白质印迹检测纳米颗粒处理后T24细胞总CD44蛋白水平的变化。通过免疫荧光共聚焦显微镜，使用CD44抗体和Cy3-siRNA荧光，观察纳米颗粒处理后不同时间点CD44在细胞内的分布变化（膜/质）以及siRNA的共定位情况。 * 溶酶体逃逸：使用LysoTracker绿色染料标记T24细胞的溶酶体，用Cy3-siRNA@CS-HAD NPs处理细胞，在不同时间点通过共聚焦显微镜观察红色荧光（siRNA）与绿色荧光（溶酶体）的重叠情况，并用Image J软件分析荧光重叠率，评估纳米颗粒的溶酶体逃逸能力。 * 凋亡诱导：通过蛋白质印迹检测纳米颗粒处理后，T24细胞中凋亡执行者caspase底物PARP的切割情况。

第五部分：血液相容性评估 * 实验方法： * 溶血实验：将不同剂量的纳米颗粒与2%红细胞悬液共孵育，测定上清液在570 nm处的吸光度，计算溶血率。溶血率低于5%视为合格。 * 凝血功能：使用全自动凝血分析仪，检测纳米颗粒与血浆混合后，对凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间和血浆纤维蛋白原的影响。

第六部分：体内抗肿瘤效果与靶向性验证 * 动物模型：使用5周龄裸鼠，皮下接种T24细胞建立移植瘤模型。2周后，将20只荷瘤裸鼠随机分为4组。 * 给药方案：通过尾静脉注射给药，每3天一次，共给药20天。分组如下：1) PBS对照组；2) siRNA@CS-HAD NPs组；3) siRNA@CS NPs组；4) 裸siRNA组。所有治疗组均给予等量（5 μg）的Bcl2-Cy3-siRNA。 * 评估指标： * 肿瘤生长抑制：每5天测量肿瘤尺寸并计算体积，治疗结束后称取肿瘤重量并计算肿瘤指数（肿瘤重/体重）。 * 体内靶向成像：末次给药4小时后，使用活体荧光成像系统观察小鼠全身及主要器官的荧光分布。 * 靶基因干扰验证：取肿瘤组织进行蛋白质印迹，检测Bcl2蛋白表达水平。 * 组织学观察：取肿瘤、肝、脾、肾等器官进行冰冻切片，观察免疫荧光分布。 * 器官毒性：称取肝、脾、肾重量并计算器官指数。

第七部分：数据分析 数据以均值±标准差表示，至少进行三次独立重复实验。采用Student’s t检验或单因素方差分析进行统计学分析，使用Prism软件作图。P < 0.05认为有显著差异，P < 0.01认为有高度显著差异。

主要结果 1. CD44表达与siRNA筛选结果：免疫组化证实，膀胱癌组织中CD44表达显著高于配对的正常组织。T24细胞中CD44表达高于5637和正常SV-HUC-1细胞。在三条siRNA中，靶向Bcl2基因1014位点的siRNA-3干扰效率最高，能在mRNA和蛋白水平分别实现约75%和50%的敲低。 2. 纳米颗粒制备与表征结果：FTIR在1733.24 cm⁻¹处确认了HAD醛基的特征吸收峰。选择氧化度适中（约25%）、分子量约15 kDa的HAD-2进行纳米颗粒修饰。所制备的siRNA@CS-HAD NPs呈球形，粒径约100-120 nm，PDI低，单分散性好。HAD共价修饰显著提高了纳米颗粒在PBS中的稳定性，6天内PDI保持低于0.1。siRNA负载效率超过95%。热重分析证实了HA的成功修饰（CS-HAD NPs比CS NPs多损失约18.34%的重量）。细胞毒性实验表明，CS-HAD NPs对正常L929细胞无明显毒性，符合生物材料应用标准。负载siRNA的靶向纳米颗粒对T24细胞的生长抑制和凋亡诱导作用最强（表现为PARP切割增加）。 3. 体外靶向递送与干扰结果：荧光显微镜和流式细胞术显示，siRNA@CS-HAD NPs的细胞摄取效率和转染率均高于商业转染试剂HiPerFect及物理吸附HA的纳米颗粒（CS-HA NPs）。共聚焦成像显示，纳米颗粒处理后，Cy3-siRNA（红）与CD44（绿）在细胞膜及内吞途径中共定位，且CD44的蛋白总量上调，其在细胞膜上的分布也发生动态变化，表明受体被激活。溶酶体逃逸实验显示，纳米颗粒内吞后1小时，大部分siRNA位于溶酶体内（重叠率92%），随时间推移逐渐逃逸，6小时后重叠率降至25%。qPCR和蛋白质印迹证实，siRNA@CS-HAD NPs能高效地下调T24细胞中Bcl2的表达。 4. 血液相容性结果：所有纳米颗粒在各测试剂量下的溶血率均低于5%。凝血指标（PT， APTT， TT， Fbg）与PBS对照组相比无显著差异，表明纳米系统具有良好的血液相容性，适合静脉注射。 5. 体内抗肿瘤与靶向性结果： * 肿瘤抑制：siRNA@CS-HAD NPs治疗组肿瘤生长受到显著抑制，肿瘤体积和肿瘤指数均显著低于PBS对照组、裸siRNA组和siRNA@CS NPs组。肝、脾、肾器官指数无显著差异，表明无明显器官毒性。 * 靶向积累：活体成像显示，仅siRNA@CS-HAD NPs组在小鼠皮下肿瘤部位有明显的Cy3荧光信号聚集，而其他组荧光信号分散。肿瘤组织切片免疫荧光也证实了该组肿瘤部位有强烈的siRNA荧光信号。 * 靶基因干扰：蛋白质印迹显示，siRNA@CS-HAD NPs组肿瘤组织内Bcl2蛋白水平显著低于对照组和其他治疗组。 * 生物分布：纳米颗粒主要经肾脏和肝脏代谢。裸siRNA在肝脏中分布较多；未修饰的siRNA@CS NPs主要累积于肾脏；而HAD修饰的siRNA@CS-HAD NPs在肾脏的累积减弱，在肝脏的分布相对增加，同时更有效地在肿瘤部位蓄积。

结论 本研究成功开发了一种基于天然大分子（壳聚糖和透明质酸）的CD44靶向基因递送系统，用于治疗膀胱癌。研究创新性地在乙醇-水混合相中简便制备了透明质酸二醛（HAD），并通过共价结合将其修饰于壳聚糖纳米颗粒表面，构建了siRNA@CS-HAD NPs。该系统粒径均一、稳定性好、siRNA负载率高、细胞毒性低、血液相容性好。体外实验证实，该系统能通过CD44受体介导的内吞作用靶向递送siRNA至膀胱癌细胞，有效沉默Bcl2癌基因并诱导细胞凋亡。体内实验进一步证明，该系统能特异性地在肿瘤部位累积，显著抑制肿瘤生长，且无明显全身毒性。该研究为膀胱癌的靶向基因治疗提供了一种具有高生物安全性和临床应用潜力的新型纳米平台。

研究亮点 1. 方法创新：开发了在乙醇-水混合相中制备透明质酸二醛（HAD）的新方法，工艺简单、产率高，便于规模化应用，并首次将其用于共价修饰壳聚糖纳米颗粒以实现靶向递送。 2. 靶向系统设计新颖：通过HAD的醛基与壳聚糖氨基的直接共价反应构建靶向系统，避免了使用额外交联剂可能带来的细胞毒性，提高了体系的生物安全性。 3. 高效的siRNA设计：通过合理设计并筛选，获得了针对Bcl2基因的高效干扰siRNA序列，其干扰效率显著。 4. 系统全面的评价：从材料表征、体外细胞靶向与机制（包括受体激活、内吞、溶酶体逃逸）、血液相容性到体内抗肿瘤疗效与靶向生物分布，进行了多层次、全方位的系统性验证。 5. 显著的转化潜力：整个系统完全由天然、生物相容性好的材料构成，制备工艺简单，体内外均显示出高效靶向和治疗效果，同时具备高安全性，具有明确的临床转化前景。

其他有价值内容 研究还比较了共价修饰（CS-HAD NPs）与物理吸附（CS-HA NPs）两种HA修饰方式的效果，证实共价修饰在细胞摄取方面更具优势，为类似靶向系统的构建提供了重要参考。此外，对纳米颗粒体内代谢途径的分析（肾脏与肝脏分布差异）为了解其生物学命运提供了有价值的数据。