学术研究报告：一种基于谢尔宾斯基三角形的异配位/三金属光敏剂用于高效治疗缺氧肿瘤
一、 主要作者、研究机构及发表信息
本研究由来自桂林医学院药物发现与优化广西重点实验室的Huan Qin, Huilin Su, Zhimin Jiang*, Yingying Li* 团队，广州大学大湾区环境研究院、中南大学化学化工学院的 Qiaolin Chen, Bangtang Chen, Jun Wang, Xiaojie Huang, Mingzhao Chen, Pingshan Wang*, Zhilong Jiang* 团队，以及中南大学化学化工学院的 Qiangqiang Dong 合作完成。通讯作者为 Zhimin Jiang、Yingying Li、Pingshan Wang 和 Zhilong Jiang。该项研究成果以题为“A Heteroleptic/Trimetallic Os(II)−Ru(II)−Zn(II) Sierpiński Triangle for Efficient Photodynamic Therapy of Hypoxic Tumors Mainly through Type I Mechanism”的论文形式，发表于 Journal of the American Chemical Society 期刊，在线发表日期为 2025年6月28日，卷期页码为 J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 23957–23971。
二、 研究学术背景
本研究隶属于生物无机化学、超分子化学与肿瘤光动力治疗（Photodynamic Therapy, PDT）的交叉领域。PDT作为一种微创、时空精度高、副作用小的癌症治疗手段，其核心在于利用光敏剂在光照下产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）来杀死肿瘤细胞。ROS的生成主要有两种机制：I型（Type I）机制涉及光敏剂与周围底物间的电子转移，产生超氧阴离子自由基（O2•−）和羟基自由基（•OH）等；II型（Type II）机制则是通过能量转移产生单线态氧（1O2）。
传统的PDT光敏剂大多遵循II型机制，其疗效高度依赖于肿瘤微环境中的氧气浓度。然而，实体肿瘤内部普遍存在缺氧区域，这严重限制了II型PDT的疗效。相比之下，I型PDT的氧气依赖性较低，在缺氧条件下仍能产生强细胞毒性的自由基，因此在治疗缺氧肿瘤方面展现出显著优势。近年来，超分子配位复合物（Supramolecular Coordination Complexes, SCCs）因其结构、几何形状及光物理化学性质可通过合理的结构设计和组分比例进行精确调控，在光动力癌症治疗中显示出巨大潜力。然而，能够实现高效I型PDT的SCC基光敏剂却鲜有报道。
谢尔宾斯基（Sierpiński）三角形是一种著名的自相似分形结构，其特殊的光学和电子性质引起了化学家的兴趣。通过配位驱动自组装构建的金属-有机谢尔宾斯基三角形是一类结构独特的SCC，其拓扑结构与传统的金属环和金属笼截然不同，有利于组装具有独特光物理性质的多核/多金属SCC。尽管化学家们已经合成了多种谢尔宾斯基三角形，但它们在生物医学领域的应用，特别是在PDT中的应用，尚未见报道。
基于此，本研究旨在设计并合成一种新型的、基于谢尔宾斯基三角形结构的SCC，作为高效的I型PDT光敏剂，以克服缺氧肿瘤治疗的瓶颈。研究的具体目标包括：1) 通过异配位/三金属策略构建一个结构新颖的谢尔宾斯基三角形（命名为ST-2）；2) 系统研究其光物理化学性质及ROS（特别是O2•−）生成能力；3) 在常氧和缺氧条件下，全面评估其体外和体内的PDT疗效及生物安全性；4) 深入探究其诱导癌细胞死亡的分子机制。
三、 详细研究流程
本研究流程系统而严谨，涵盖了从分子设计合成、性能表征到体外、体内生物学评价及机制探究的全链条。
第一步：光敏剂ST-2的设计、合成与结构表征 研究首先设计了由联吡啶锇(II)（Os(II)）构筑单元L1和三核三联吡啶钌(II)（Ru(II)）构筑单元L2与Zn2+离子通过配位驱动自组装形成异配位/三金属谢尔宾斯基三角形ST-2。选择Os(II)中心旨在利用其更强的重原子效应来红移吸收和发射光谱，增强自旋轨道耦合以加速系间窜越（Intersystem Crossing, ISC）和提高三重态产率，从而促进ROS生成。L1和L2通过有机合成方法制备，并通过一维/二维核磁共振（NMR）、电喷雾电离质谱（ESI-MS）进行了充分表征。
随后，将L1、L2与Zn(ClO4)2在乙腈中混合，通过配位自组装成功合成了ST-2。研究团队使用了多种技术对其结构和纯度进行了全面表征： 1. 核磁共振氢谱（1H NMR）：谱图显示了对应于配位后三联吡啶特定质子的四个单峰，比例符合预期，且非芳香区出现尖锐的单峰，表明形成了单一、对称的超分子结构。二维相关谱（COSY）、核奥弗豪泽效应谱（NOESY）和扩散排序谱（DOSY）进一步证实了结构的统一性和高纯度，DOSY显示所有信号对应同一个扩散系数（D = 2.14 × 10−10 m2/s）。 2. 质谱分析：ESI-MS谱图显示了一系列从14+到6+的连续多电荷峰，对应于逐步失去PF6−抗衡离子。测得的分子量为11641 Da，与ST-2的理论化学式C456H312Zn6F144N72O6P24Ru3Os3完美吻合。实验测得的同位素分布与理论模拟高度一致。 3. 离子淌度质谱（TWIM-MS）：从12+到7+电荷态观察到的狭窄漂移时间分布，确认了ST-2形成了单一的离散结构，且异构体纯度高。 4. 高效液相色谱（HPLC）：分析显示ST-2的纯度高达98.3%。 5. 其他表征：通过斯托克斯-爱因斯坦方程计算的水合动力学半径（2.82 nm）与模拟的三角形边长（~5.9 nm）相符。扫描电镜元素映射图显示了所有元素（C, N, O, F, P, Zn, Ru, Os）的均匀分布。
这些数据强有力地证实了目标产物ST-2的成功合成及其作为单一、高纯度、结构明确的超分子实体的特性。
第二步：光物理化学性质及溶液中的ROS生成研究 研究团队首先测定了ST-2及其前体L1、L2的光物理性质。ST-2在400-550 nm范围内显示出宽的金属-配体电荷转移吸收带，在855 nm处有近红外荧光发射，量子产率为21%，荧光寿命为0.55 ns，这种近红外发射特性为其用于生物成像引导的PDT提供了可能。
随后，系统评估了它们在溶液中的ROS生成能力： 1. 总ROS生成：使用通用ROS探针DCFH检测。在450 nm激光照射下，ST-2诱导的DCF荧光增强（526倍）远高于L1和L2（约141-142倍），表明ST-2具有极高的ROS生成效率。 2. ROS类型鉴定与定量： * 单线态氧（1O2）：使用电子顺磁共振（EPR，以TEMP为捕获剂）和化学探针ABDA检测。ST-2、L1和L2均能产生1O2，其1O2量子产率（ΦΔ）分别为15%、16%和13%，三者相近。 * 超氧阴离子（O2•−）：使用EPR（以DMPO为捕获剂）和荧光探针DHE检测。ST-2、L1和L2也都能产生O2•−。关键发现是，ST-2的O2•−生成效率显著高于L1和L2。 3. 主要ROS类型确定：通过向ST-2的DCFH检测体系中分别加入O2•−清除剂Tiron和1O2清除剂NaN3，发现Tiron能显著抑制荧光增强，而NaN3的抑制效果较弱。结合DCFH、ABDA和DHE的实验数据综合分析，得出结论：O2•−是ST-2在光照下产生的主要ROS类型。
这部分结果表明，ST-2不仅ROS总产量极高，而且能显著促进I型机制相关的O2•−生成，预示其有望成为高效的I型光敏剂。
第三步：体外PDT疗效评估 在细胞实验前，确认了ST-2在生理缓冲液和细胞培养基中具有良好的化学稳定性和光稳定性，且不易聚集。其脂水分配系数（log P o/w = 2.33）表明其具有较高的亲脂性，有利于细胞摄取。 1. 细胞毒性测试（MTT法）：在常氧和缺氧（1% O2）条件下，测试了ST-2对多种癌细胞系（4T1, MDA-MB-231, MCF-7, HeLa, A549）和正常细胞（MCF-10A, HUVECs）的暗毒性和光毒性（450 nm光，20 min, 12 J/cm2）。结果显示，ST-2对所有测试的癌细胞系均表现出极低的光毒性IC50值（0.052 – 0.154 μM），光毒性指数高达50.6至1160，且在缺氧条件下疗效仅轻微下降。相比之下，其对正常细胞的暗毒性和光毒性均很低。作为对照的L1、L2、Ru(bpy)3Cl2和顺铂的光毒性远低于ST-2。 2. 活/死细胞染色：使用钙黄绿素-AM（活细胞，绿）和碘化丙啶（死细胞，红）对4T1细胞进行染色，直观证实了ST-2联合光照能高效杀死癌细胞，且该效应在常氧和缺氧条件下效果相当。 3. 细胞内ROS生成：使用DCFH-DA、SOSG（特异性检测1O2）和DHE（特异性检测O2•−）探针进行荧光显微镜和流式细胞术分析。结果显示，ST-2在细胞内能高效产生ROS。特别重要的是，在常氧下，ST-2能同时产生O2•−和1O2，但使用Tiron清除O2•−能几乎完全抑制其光毒性，而使用NaN3清除1O2对其光毒性影响较小，再次证实O2•−是其主要效应分子。在缺氧下，ST-2只能检测到O2•−的生成，而无1O2产生，但光毒性依然显著，这直接证明了ST-2主要通过I型PDT机制杀伤细胞，且其疗效具有缺氧耐受性。
第四步：细胞死亡机制探究 1. 细胞摄取与亚细胞定位：共聚焦显微镜显示ST-2可被4T1细胞有效摄取，并主要定位于线粒体（与线粒体染料共定位系数高），部分分布于溶酶体。ICP-MS定量分析进一步证实了细胞及线粒体内Ru和Os的含量较高，且比例接近1:1，说明ST-2在细胞内结构稳定。 2. 细胞器损伤：使用JC-1探针检测线粒体膜电位，发现ST-2光照后线粒体膜电位显著下降；使用吖啶橙检测溶酶体完整性，发现ST-2光照后溶酶体遭到破坏。这表明ST-2的PDT作用导致了线粒体和溶酶体功能障碍。 3. 细胞凋亡与周期分析：Annexin V-FITC/PI双染流式分析显示，ST-2联合光照诱导了79.4%的细胞凋亡。细胞周期分析显示，该处理使细胞周期阻滞在G2/M期。此外，伤口愈合实验表明，ST-2联合光照能显著抑制癌细胞的迁移能力。
第五步：三维多细胞肿瘤球体（MCTS）模型评估 使用4T1细胞构建的3D MCTS模型模拟实体瘤。ST-2联合光照处理能导致MCTS从外周向内部逐渐瓦解、崩塌。活/死染色显示该处理能有效杀死球体内的细胞。ROS检测显示，即使在MCTS内部的缺氧区域，ST-2仍能有效生成ROS，进一步证实了其穿透能力和缺氧条件下的有效性。
第六步：体内PDT疗效与生物安全性评估 在4T1荷瘤小鼠模型中进行体内实验。通过瘤内注射给药（1.5 mg/kg），并在24小时后对瘤区进行450 nm激光照射（20 min, 60 J/cm2）。 1. 抑瘤效果：与对照组、顺铂组和仅ST-2组相比，ST-2联合光照组的小鼠肿瘤生长被几乎完全抑制，治疗14天后肿瘤体积和重量减少了94%以上。肿瘤组织切片H&E染色显示严重的结构破坏和坏死，TUNEL染色显示大量细胞凋亡，Ki67染色显示细胞增殖被显著抑制。 2. 生物安全性：治疗期间小鼠体重无明显变化，无死亡。主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E切片未观察到明显病理损伤。血液生化指标（ALT, AST, Crea, BUN, CK-MB）均在正常范围内。这些结果表明ST-2在有效治疗剂量下具有良好的体内生物安全性。
四、 主要研究结果
本研究取得了一系列系统而相互印证的成果： 1. 成功合成与表征：首次通过配位驱动自组装，构建并完全表征了一种结构新颖的异配位/三金属（Os(II)-Ru(II)-Zn(II)）谢尔宾斯基三角形超分子光敏剂ST-2。 2. 优异的光物理与ROS生成特性：ST-2具有可见光吸收和近红外发射特性。其最突出的特点是ROS总生成效率极高，且能特异性促进I型PDT相关的O2•−的生成，而1O2量子产率与单体相当。 3. 卓越的体外PDT疗效：ST-2对多种癌细胞系表现出亚纳摩尔级别的极低光毒性IC50值和极高的光毒性指数，且在缺氧条件下疗效依然卓越，这是传统II型光敏剂难以实现的。 4. 明确的I型PDT作用机制：通过系统的细胞内ROS类型鉴定和清除剂实验，明确证实了ST-2主要通过产生O2•−（I型机制）来诱导细胞死亡，其疗效不严重依赖于氧气浓度。 5. 深入的机制阐释：ST-2主要定位于线粒体和溶酶体，通过光照产生活性氧导致这些细胞器损伤，进而引发细胞凋亡、细胞周期阻滞，并抑制细胞迁移。 6. 有效的3D模型杀伤：ST-2能有效瓦解3D肿瘤球体，证明其对实体瘤样结构具有破坏力。 7. 显著的体内抗肿瘤效果与良好安全性：在动物模型中，ST-2联合光照能几乎完全根除肿瘤，且对正常组织和器官无明显毒性，展示了其巨大的临床转化潜力。
这些结果层层递进，从分子性质到细胞机制，再到组织模型和活体动物，完整地论证了ST-2作为高效、缺氧耐受型I型光敏剂的有效性与安全性。
五、 研究结论与价值
本研究的结论是：成功开发了一种基于谢尔宾斯基三角形分形结构的异配位三金属超分子配合物ST-2，该化合物能够通过促进I型光反应，高效产生超氧阴离子自由基，从而在常氧和缺氧条件下均能实现高效的光动力治疗，主要经由I型PDT机制诱导肿瘤细胞死亡，并在小鼠模型中展现出卓越的抑瘤效果和良好的生物安全性。
本研究的科学价值在于： 1. 开辟了新方向：这是首次报道谢尔宾斯基三角形结构在PDT乃至生物医学领域的应用，为这类具有独特拓扑结构的SCC开辟了全新的生物应用场景。 2. 提供了新策略：为开发高效SCC基I型光敏剂提供了一种创新的设计策略——通过构建异配位/多金属的谢尔宾斯基三角形分形结构，整合不同金属中心的优势，协同增强ROS（特别是O2•−）的生成能力。 3. 实现了新突破：ST-2是首个在一个结构中包含三种不同金属的SCC，也是首个报道的具有PDT活性的谢尔宾斯基三角形。其在缺氧条件下仍能保持亚纳摩尔级别的光毒性，代表了I型PDT光敏剂研发的一个重要进展。 4. 具有明确的转化医学价值：该研究为解决实体瘤缺氧微环境限制PDT疗效这一临床难题提供了有前景的候选化合物和可行的技术路径。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
文章也指出了当前研究的局限性及未来方向：ST-2的激活波长（450 nm）较短，对深层组织的穿透能力有限。作者提出，未来的工作将集中于改进光疗波长（如开发近红外激发的类似物），并深入阐明这类谢尔宾斯基三角形的构效关系，以进一步优化其治疗潜力。这体现了研究的严谨性和前瞻性。此外，文中提出的ST-2高性能归因于其刚性三角形结构的“抗猝灭效应”、多重重金属原子增强的ISC效率、以及PF6−抗衡离子提供的富电子环境有利于电子转移等观点，为后续的理性分子设计提供了理论参考。