自然产物药物开发中靶点识别与验证的关键技术：CETSA与热蛋白质组谱分析策略综述
本文由Yanbei Tu（江苏大学药学院）、Lihua Tan（澳门大学中药质量研究国家重点实验室）、Hongxun Tao（江苏大学食品与生物工程学院）、Yanfang Li（四川大学化学工程学院）和Hanqing Liu（江苏大学药学院）共同撰写，作为一篇综述性文章发表于Phytomedicine期刊第116卷（2023年）。文章系统性地回顾和总结了自2013年以来发展的细胞热位移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）技术及其衍生策略，特别是热蛋白质组谱分析（Thermal Proteome Profiling, TPP），在天然产物（Natural Products, NPs）靶点验证、靶点识别及先导化合物发现领域的应用进展、优势和未来展望。
文章的主要论点与论述
一、 天然产物药物开发面临的挑战与靶点识别技术现状 文章开篇即强调了天然产物在创新药物研发中的核心地位。数据显示，从1981年至2019年美国FDA批准的小分子药物中，超过63%直接或间接来源于天然产物或其结构模仿。然而，天然产物的药物开发面临一个关键瓶颈：靶点去卷积（Target Deconvolution）与靶点参与（Target Engagement）的确定。许多天然产物最初通过表型筛选发现，其作用靶点未知。同时，天然产物常表现出多靶点（Polypharmacology）特性，使得明确其真正的药效靶点谱系变得极具挑战性。
文章将现有的靶点识别策略分为两大类：间接策略和直接策略。间接策略（如差异表达转录组学/蛋白质组学、细胞绘画、遗传学方法）基于表型变化推断靶点，需要后续假设驱动的研究来验证，不提供药物-靶点相互作用的直接证据。直接策略则能够直接评估相互作用，主要包括化学蛋白质组学、蛋白质芯片、反向对接和生物物理方法。其中，化学蛋白质组学（包括化合物中心化学蛋白质组学CCCp和活性基团蛋白质谱分析ABPP）在过去几十年是强有力的工具，但它们通常需要对天然产物进行化学修饰以制备探针，这可能改变其生物活性和结合特异性，且对于结构复杂或含量极低的天然产物而言，化学修饰本身可能难以实现。
在此背景下，一系列无需标记（Label-free） 的生物物理方法应运而生，它们通过检测药物结合后蛋白质生物物理性质（如蛋白酶解敏感性、热稳定性、氧化稳定性）的变化来评估相互作用。这类方法包括药物亲和响应靶点稳定性（Darts）、脉冲蛋白酶解（PP）、细胞热位移分析（CETSA）、氧化速率蛋白质稳定性（SPROx）、溶剂诱导蛋白质沉淀（SIP）和化学变性蛋白质沉淀（CPP）等。文章指出，在这些方法中，CETSA因其独特的优势——能够在生理相关环境（如完整细胞、细胞裂解液、组织）中直接、原位评估药物-靶点相互作用——而脱颖而出，成为近年来天然产物研究中的热点技术。
二、CETSA的基本原理及其三大衍生策略框架 文章详细阐述了CETSA的核心原理：配体（药物）结合可以提高其靶点蛋白的热稳定性，使其在相同加热温度下比未结合蛋白更不易变性沉淀。基于这一配体诱导的热稳定现象，CETSA的基本流程包括：样品（活细胞、裂解液或组织）经药物处理、短时间梯度加热、细胞裂解（活细胞/组织需要）、高速离心去除变性沉淀蛋白、最后对剩余的可溶性蛋白进行定量检测。
根据检测剩余可溶性蛋白的定量技术不同，CETSA衍生出三种主要策略格式： 1. 经典WB-CETSA：使用基于抗体的Western Blot分析来检测特定目标蛋白的热稳定性变化。该方法主要用于靶点验证，优势在于操作简单、无需纯化蛋白、无需修饰天然产物，但通量低且依赖于高质量抗体的可获得性。 2. 热蛋白质组谱分析（TPP，亦称MS-CETSA）：使用基于质谱（MS）的定量蛋白质组学进行全蛋白质组范围的鉴定与定量，从而在生理相关环境中获得蛋白质稳定性谱。TPP及其改进方法是无偏见的、全局性靶点识别的理想工具。 3. 高通量CETSA（HT-CETSA）：通过与均相检测平台（如AlphaScreen、报告基因发光法、免疫荧光）结合，将CETSA转化为高通量格式，用于大规模化合物库的靶点参与度筛选，适用于药物先导化合物的发现与优化。
三、经典WB-CETSA在天然产物靶点验证中的应用与实践要点 文章通过一个详尽的表格（表1）列举了近年来WB-CETSA用于验证多种结构类型天然产物靶点的代表性案例，包括萜类、黄酮类、异黄酮类、生物碱和酚类等，这些天然产物具有抗癌、抗炎、神经保护等多种药理活性。WB-CETSA通常作为化学蛋白质组学、虚拟筛选、网络药理学等其他靶点识别方法的后续验证步骤，为细胞内靶点相互作用提供直接证据。
文章特别强调了成功实施WB-CETSA及等温剂量反应CETSA（ITDR-CETSA，用于评估剂量依赖性结合及计算EC50值）的关键实验考虑因素： * 药物处理：活细胞中药物浓度通常与活性实验一致，而裂解液中则需要更高浓度（通常为活细胞浓度的10倍）。处理时间需平衡靶点饱和与避免下游效应。 * 加热温度与时间：温度范围取决于目标蛋白的热变性特性，需通过预实验确定。典型的加热时间为3-5分钟。过度加热可能破坏细胞膜完整性，导致假阳性。 * 细胞裂解与离心：推荐使用0.4% NP-40等温和去垢剂裂解缓冲液，以避免干扰蛋白检测并有助于膜蛋白溶解。离心速度应足够高（如13，000 rpm以上，20分钟）以确保彻底去除沉淀。 * 组织水平验证：WB-CETSA同样适用于组织样本，不仅能验证体内结合，还能提供药物在靶组织分布的信息，但相关研究报道较少，未来值得重视。
四、TPP及其多样化改进策略在天然产物靶点识别中的进展 这是文章的核心部分，作者详细介绍了多种TPP策略及其在天然产物研究中的应用案例（表2），突出了该领域的技术创新和适用性拓展。
标准TPP：TPP-TR与TPP-CCR：TPP温度范围（TPP-TR）实验类似于WB-CETSA，在固定药物浓度下检测温度依赖的蛋白质组热稳定性变化，得到熔解曲线和Tm值。TPP化合物浓度范围（TPP-CCR）实验则类似于ITDR-CETSA，在固定温度下检测药物浓度依赖的热稳定性变化，得到剂量反应曲线和pEC50值。两者结合可以更可靠地识别真阳性靶点。文章列举了使用TPP-TR或TPP-CCR成功识别Staurosporine（靶向多种激酶）、奎宁（靶向PfPNP）、Vioprolide A（靶向NOP14）、白术内酯I（靶向PSMD4）、4,4‘-二甲氧基查尔酮（靶向ALDH1A3和FECH）、南蛇藤碱（靶向GPX4）以及土木香内酯（靶向AKR1C1）等天然产物靶点的案例。
二维TPP（2D-TPP）：结合了TPP-TR和TPP-CCR，同时测试多个药物浓度和多个温度点，结果以二维热图呈现。它能同时提供热稳定性和药物亲和力信息，灵敏度更高，并能区分由药物结合引起的稳定性变化和由药物影响表达或翻译后修饰引起的变化。该策略已成功用于揭示上市药物帕比司他的脱靶效应，但在天然产物研究中的应用尚未见报道。
细胞表面TPP（CS-TPP）：针对膜蛋白靶点识别的挑战而开发。在加热后，对活细胞膜蛋白进行特异性生物素化标记和富集，再进行质谱分析。该策略成功鉴定了强心苷Ouabain的已知靶点Na+/K+-ATPase亚基，证明了其在膜蛋白靶点发现中的潜力。
简化TPP（STPP）：为了降低成本和时间而设计。它仅在单一（或少数几个）温度点和一个饱和药物浓度下进行，通过比较药物处理与对照样本间可溶性蛋白丰度的差异来识别靶点，而无需构建完整的熔解曲线。STPP可与多种标记策略（如SILAC、二甲基标记）兼容，甚至可采用无标记质谱。文章列举了STPP在多种天然产物靶点识别中的应用，如哈明碱（靶向DYRK1A等激酶）、原儿茶醛（靶向胶原I）、Artone（靶向ASF1A）、Kurarinone（靶向sEH）以及人参皂苷共同靶点AK5等。
基于热稳定性变化的二维凝胶电泳荧光差异（TS-FITGE）：另一种低成本替代方案。使用不同荧光染料标记药物处理和对照样本的可溶性蛋白组，混合后进行双向凝胶电泳分离。通过分析凝胶点上荧光信号比值（Cy5/Cy3）随温度的变化来识别靶点蛋白。该方法已成功用于识别Bryostatin 1（靶向PKCα）和Hordenine（靶向NPM）的靶点。
沉淀物支持TPP（PSTPP）：一种改进策略，同时分析加热后的可溶性蛋白组分和沉淀蛋白组分，整合两部分的互补信息来提高靶点识别的灵敏度和特异性。该方法以更少的温度点（通常5个）实现了比标准TPP更高的靶点检出率（以Staurosporine为例）。
此外，文章还指出TPP策略不仅可用于发现活性靶点，也可用于识别有毒天然产物的毒性靶点（如Tutin的毒性靶点为钙调神经磷酸酶）以及揭示药物的脱靶效应，这对于全面理解药物的作用机制和副作用至关重要。
五、CETSA策略的优势、局限与未来展望 文章在结论部分总结了CETSA策略用于天然产物研究的核心优势： 1. 无需标记：无需对天然产物进行化学修饰，保留了其原始结构和活性，特别适用于结构复杂或难以修饰的天然产物。 2. 生理相关性：可直接在活细胞、组织等复杂生理环境中进行，能反映真实的细胞内相互作用。 3. 应用广泛：覆盖从靶点验证（WB-CETSA）、全局性靶点识别（TPP）到高通量先导化合物筛选（HT-CETSA）的药物研发全链条。 4. 适用于混合物：理论上可用于研究天然产物混合物或植物提取物的靶点，有助于阐释多组分协同作用机制。
同时，文章也客观指出了当前存在的局限性，例如：WB-CETSA依赖特异性抗体且通量低；标准TPP实验成本高、流程复杂；某些策略（如STPP、TS-FITGE）可能存在灵敏度或通量上的妥协；热稳定性变化不一定总代表直接结合（可能受下游效应影响），需要结合其他实验进行验证。
对于未来展望，作者认为CETSA和TPP技术的持续积累与发展，将极大加速天然产物作用机制的阐明和先导化合物的发现，为天然产物治疗特定疾病提供强有力的证据。这些策略的应用价值将远超初始投入，并为未来基于天然产物的药物研发开辟更多可能性。未来的发展可能集中在进一步提高技术的灵敏度、通量和自动化程度，拓展在更复杂生物体系（如动物模型、临床样本）中的应用，以及开发更高效的数据分析算法。
六、本文的学术价值与意义 本综述的系统性和时效性是其重要价值所在。它不仅清晰梳理了CETSA技术从诞生到衍生出多种策略的发展脉络，更重要的是，首次针对天然产物研究领域，全面汇总和评述了各种CETSA/TPP策略的成功应用案例、具体实验方案、关键注意事项以及各自的优缺点。文中提供的两个总结性表格（表1和表2）极具参考价值，为从事天然产物药理和药物开发的研究者提供了清晰的“技术路线图”和丰富的实践指南。文章强调的“无需标记”和“生理环境”两大特性，精准地切中了天然产物靶点研究的传统痛点，为克服化学蛋白质组学等方法的技术瓶颈提供了有力的替代和补充方案。因此，这篇综述不仅是技术进展的总结，更是推动该技术在天然产物领域更广泛、更深入应用的催化剂，具有重要的指导意义。