研究背景与发表信息
该研究由比利时鲁汶大学（KU Leuven）的多学科团队完成，主要作者包括Laura Rué、Tom Jaspers、Isabelle M. S. Degors、Sam Noppen、Dominique Schols、Bart De Strooper和Maarten Dewilde。其中Bart De Strooper同时隶属于英国伦敦大学学院（University College London）的英国痴呆症研究所（UK Dementia Research Institute）。该研究成果以通讯（Communication）形式发表于期刊《Pharmaceutics》2023年第15卷第6期，文章编号1748，于2023年6月16日正式发表。研究团队主要来自鲁汶大学的治疗与诊断抗体实验室、脑与疾病研究中心、神经退行性疾病研究实验室以及Rega研究所的病毒学与化疗实验室。
研究背景与目的
血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）是中枢神经系统（central nervous system, CNS）的重要守门人，但其存在也构成了神经系统疾病治疗中的关键瓶颈。绝大多数生物制剂（biologicals）无法以足够数量到达脑内靶点，外周给药后仅不足0.1%的剂量能够进入脑实质，这迫使临床上使用高剂量给药，由此带来潜在副作用和高昂治疗成本。受体介导的转胞吞作用（receptor-mediated transcytosis, RMT）是一种生理性物质转运机制，利用内皮细胞表面特异性受体识别营养物质并将其通过囊泡转运至脑实质。靶向RMT受体的抗体策略已被证明能够有效提高生物制剂的脑内通透性，其中转铁蛋白受体（transferrin receptor, TFR）是脑内药物递送中最为广泛应用的RMT靶点之一。
纳米抗体（nanobody）是骆驼科重链抗体的可变区结构域，具有分子量小、稳定性高、易于工程化改造等理想特性，适用于构建多特异性构建体。研究团队此前已分别获得了抗小鼠TFR纳米抗体（nb62）和抗人TFR纳米抗体（nb188），二者均能有效将治疗性分子递送至脑内。然而，后续研究发现nb188无法结合食蟹猴（cynomolgus）TFR，尽管人与食蟹猴TFR的顶端结构域（apical domain）具有95%的序列同源性。这一缺陷严重阻碍了该纳米抗体在非人灵长类（non-human primate, NHP）中的临床前安全性和有效性评价。根据监管指南，药物在进入人体试验前通常需要在两种动物种属中完成非临床毒理学测试，即一种啮齿类和一种非啮齿类。因此，开发能够同时识别人和食蟹猴TFR的纳米抗体具有重要的转化医学价值。本研究的目标即为发现并验证能够结合人与食蟹猴TFR的交叉反应性纳米抗体，并评估其作为脑内生物制剂递送工具的在体效能。
研究设计与方法流程
该研究包含三个主要阶段：纳米抗体的发现与筛选、体外结合特性表征以及体内功能验证。
在纳米抗体发现阶段，研究团队采用了靶向免疫策略。由于已知能够穿越血脑屏障的TFR结合分子均靶向TFR顶端结构域，团队构建了一种嵌合DNA免疫原，将羊驼TFR序列中的顶端结构域替换为食蟹猴TFR的顶端结构域序列。三只羊驼接受了四次每两周一次的DNA免疫，免疫原为编码该嵌合TFR的pVAX1质粒。免疫后第4天和第8天采集外周血淋巴细胞总RNA，反转录后经PCR扩增纳米抗体编码序列，并克隆入噬菌粒载体，构建了靶向纳米抗体噬菌体展示文库。随后进行了两轮细胞筛选：第一轮使用过表达食蟹猴TFR的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，第二轮使用过表达人TFR的CHO细胞。第二轮筛选后的输出文库被亚克隆至表达载体并转化至大肠杆菌TG1细胞。从筛选后的文库中挑取95个单克隆进行测序，经序列聚类后筛除了重复序列，最终对32个非冗余克隆进行周质提取物的小规模表达和流式细胞术筛选。结果显示仅8个克隆同时结合人和食蟹猴TFR，其中7个克隆间序列同源性超过91%。基于序列差异，团队选择了两个代表性克隆——BBB00515和BBB00533——进行后续表达、纯化和表征。
体外表征阶段包括流式细胞术结合验证和表面等离振子共振（surface plasmon resonance, SPR）动力学分析。纯化后的BBB00515和BBB00533均能结合过表达人或食蟹猴TFR的CHO细胞，但不结合小鼠TFR过表达细胞或仅表达绿色荧光蛋白（GFP）的对照细胞。SPR实验使用生物素化重组人TFR和食蟹猴TFR固定在链霉亲和素芯片上，结果显示BBB00515对食蟹猴TFR的平衡解离常数（K_D）为63.00 ± 1.20 nM，对人TFR的K_D为1183.67 ± 423.81 nM，即对食蟹猴TFR的亲和力约为对人TFR的18倍。BBB00533对食蟹猴TFR的K_D为103.77 ± 8.14 nM，对人TFR的K_D为207.00 ± 27.84 nM，二者亲和力差异仅约2倍，表现出更好的种间亲和力平衡性。
体内功能验证阶段采用了BACE1（β-位点淀粉样前体蛋白切割酶）抑制作为脑内递送效能的功能读出指标。研究团队将BBB00515和BBB00533分别与亲和力成熟的抗BACE1单克隆抗体1A11Am融合，构建了异二聚体双特异性抗体BBB00574（携带BBB00515）和BBB00578（携带BBB00533）。构建体采用knobs-into-holes（KiH）技术实现Fc异二聚化，并引入L234A、L235A、P329G等效应功能沉默突变。双特异性抗体的体外结合验证显示二者均能结合人TFR过表达细胞，并能通过生物层干涉测量（bio-layer interferometry, BLI）以约0.3 nM的K_D结合重组人BACE1蛋白。体内实验使用hAPI KI小鼠模型，该小鼠内源性启动子驱动表达顶端结构域被人源序列替代的嵌合小鼠TFR。双特异性抗体以167 nmol/kg的剂量经尾静脉注射，24小时后采集血浆和脑组织，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）定量Aβ1-40水平作为BACE1抑制的读出指标。
主要结果与发现
流式细胞术筛选结果显示，从95个测序克隆和32个非冗余克隆中，仅8个克隆能够同时结合人和食蟹猴TFR，表明获得跨种属交叉反应性结合子的效率较低，这也印证了研究团队此前经验中关于获得人/食蟹猴TFR双结合纳米抗体具有挑战性的判断。在选定的两个纳米抗体中，BBB00533因其对人源和食蟹猴TFR的亲和力差异较小，被认为最具临床前开发价值。
SPR动力学分析为两个纳米抗体的种属选择性提供了定量依据。BBB00515对食蟹猴TFR的亲和力显著高于对人TFR，这种亲和力偏向可能使基于食蟹猴临床前研究结果预测人体脑内累积量时产生偏差。相比之下，BBB00533对两个种属的TFR亲和力处于同一数量级，且差异仅为约2倍，更符合理想的临床前开发要求。值得注意的是，尽管BBB00515对人TFR的K_D超过1 μM，但在与1A11Am融合后仍然能够介导有效的脑内递送，这说明TFR亲和力并非决定脑内递送效率的唯一因素。
体内功能验证实验的结果表明，与PBS对照组相比，注射BBB00574或BBB00578的小鼠血浆Aβ1-40水平降低了60%，脑内Aβ1-40水平降低了40%，差异均具有统计学显著性（p < 0.0001）。这一结果具有多重意义：首先，血浆Aβ1-40的降低证实了双特异性抗体中外周BACE1抑制活性得到保留；其次，脑内Aβ1-40的显著降低表明纳米抗体成功介导了1A11Am穿越血脑屏障并进入脑实质发挥药理作用；第三，此前研究已证明单独静脉注射相同剂量的1A11Am抗体不能降低脑内Aβ1-40水平，而1A11Am与抗GFP纳米抗体的融合构建体同样无效，因此本研究中脑内Aβ的降低可归因于BBB00515和BBB00533介导的TFR靶向RMT转运。研究团队还讨论了“外周沉降假说”的可能性，但基于多项遗传学和药理学研究证据，外周BACE1抑制并不会导致脑内Aβ水平的降低，因此排除了脑内Aβ降低源于外周效应的解释。
结论与应用价值
本研究成功鉴定了两个能够结合人和食蟹猴TFR的纳米抗体BBB00515和BBB00533。其中BBB00533对人源和食蟹猴TFR具有相近的亲和力，这一特性使其成为进一步临床前开发的优先候选分子。当与抗BACE1抗体1A11Am融合构建双特异性抗体后，两种纳米抗体均能在体内介导生物制剂穿越血脑屏障，实现脑内BACE1抑制和Aβ1-40水平的显著降低。该研究解决了此前抗人TFR纳米抗体缺乏非人灵长类交叉反应性的关键问题，为临床前毒理学和药效学评价提供了可行的工具分子。若后续在非人灵长类中能够验证其脑内递送效能，这些纳米抗体将具备临床转化潜力，可用于增强多种治疗性生物制剂的脑内通透性，对神经系统疾病的生物治疗具有重要意义。
研究亮点
本研究的突出贡献体现在以下几个方面：首先，通过嵌合DNA免疫策略将免疫应答精准导向TFR顶端结构域，有效提高了获得交叉反应性纳米抗体的成功率。其次，BBB00533的发现填补了抗人TFR纳米抗体缺乏非人灵长类交叉反应性的空白，具有明确的转化医学价值。第三，研究系统比较了两种不同种属亲和力特征的纳米抗体在体内递送效能上的表现，提示TFR亲和力与脑内递送效率之间存在非线性关系。第四，利用BACE1抑制和Aβ降低作为脑内递送的功能读出指标，提供了直接的药效学证据，而非仅依赖抗体脑内浓度的药代动力学测量。