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新型内吞诱导蛋白（endotags）的设计及其在靶向降解和信号放大中的应用
1. 研究作者、机构及发表信息
本研究由Buwei Huang（华盛顿大学）、Mohamad Abedi（华盛顿大学）、Green Ahn（斯坦福大学）等来自多个机构的合作团队完成，通讯作者为David Baker（华盛顿大学蛋白质设计研究所）。研究于2025年2月20日发表在《Nature》期刊（Volume 638）。
2. 学术背景
研究领域：蛋白质工程、细胞表面受体调控、靶向蛋白降解。
研究动机：细胞表面受体的内吞（endocytosis）和溶酶体降解是调控信号传导和蛋白稳态的关键机制。目前，基于天然配体的靶向降解技术（如LYTACs、KineTACs）存在局限性，例如与内源配体竞争、化学修饰复杂、组织特异性不足等。因此，本研究旨在通过计算蛋白质设计开发新型内吞诱导蛋白（endocytosis-triggering binding proteins, endotags），以实现更高效、组织特异性的靶向降解和信号调控。
3. 研究流程与方法
研究分为以下几个关键步骤：
（1）endotags的设计策略
针对四类受体（IGF2R、ASGPR、sortilin、TfR），研究团队采用不同的设计策略：
- 正交结合（orthogonal binding）：针对sortilin和TfR（转铁蛋白受体），设计不与天然配体竞争的结合蛋白，避免干扰内源性信号。
- 构象触发（conformational change）：针对IGF2R（胰岛素样生长因子2受体），设计双表位结合蛋白，模拟天然配体诱导的受体构象变化。
- 受体聚类（receptor clustering）：针对ASGPR（去唾液酸糖蛋白受体），设计多价结合蛋白，通过寡聚化触发内吞。
实验方法：
- 计算设计：使用Rosetta和AlphaFold2预测蛋白质结构，结合ProteinMPNN优化序列。
- 酵母展示筛选：通过流式细胞分选（FACS）筛选高亲和力结合蛋白。
- 生物层干涉仪（BLI）：测定结合亲和力（KD值）。
（2）endotags的功能验证
- 细胞摄取实验：荧光标记的endotags与靶细胞（如U-251MG胶质瘤细胞、Jurkat T细胞）孵育，通过流式细胞术和共聚焦显微镜观察内吞效率。
- 例如，sortilin endotag在2小时内摄取效率提升90倍，且与溶酶体标记物共定位。
- 靶蛋白降解实验：将endotags与靶向蛋白（如EGFR、PD-L1抗体）融合，构建“蛋白质-LYTACs（pLYTACs）”，通过Western blot和定量蛋白质组学检测降解效果。
- 结果显示，EGFR在48小时内降解率达80%，且依赖特定受体（如IGF2R敲除后降解消失）。
（3）应用拓展
- 可溶性蛋白清除：将endotags与IgG结合蛋白（如protein G）融合，成功清除溶液中的抗体（70%清除率）。
- 逻辑门控降解：利用Co-LOCKR系统实现“与门”调控（如仅在HER2+细胞中降解EGFR）。
- 信号放大：将endotags与合成受体（如ortho-SNIPR）融合，使信号激活增强近100倍。
4. 主要结果
- 高效内吞与降解：设计的endotags显著提升靶蛋白的内吞效率（如ASGPR endotag-3C摄取增加4.5倍），并实现溶酶体靶向降解。
- 组织特异性：不同endotags基于受体分布（如ASGPR在肝脏富集）实现组织选择性降解。
- 治疗潜力：在小鼠肿瘤模型中，PD-L1抗体融合endotag后疗效显著提升（肿瘤体积减小，生存期延长）。
5. 研究结论与意义
- 科学价值：首次通过计算设计实现非天然内吞诱导蛋白的开发，突破了天然配体的限制。
- 应用价值：为靶向降解（如癌症、自身免疫病）、核酸递送（如siRNA）和合成生物学（如逻辑门控治疗）提供了模块化工具。
- 创新性：
- 方法学：结合计算设计与实验验证，实现高精度蛋白质工程。
- 技术拓展：首次将内吞调控应用于信号放大和局部分泌治疗。
6. 研究亮点
- 多机制设计：针对不同受体特性（构象变化、聚类等）定制endotags。
- 全蛋白体系：无需化学修饰，支持基因编码和细胞分泌表达。
- 跨界应用：从基础机制（内吞调控）到治疗（肿瘤、自身免疫病）的完整转化链条。
7. 其他价值
- 工具开发：提供开源设计流程（Rosetta、AlphaFold2），可推广至其他受体系统。
- 临床潜力：已在小鼠模型中验证安全性，为后续临床试验奠定基础。
这篇研究为蛋白质工程和靶向治疗领域提供了突破性工具，其模块化设计和广泛适用性预示着巨大的转化潜力。