本研究由华东理工大学药学院、上海交通大学系统生物医学研究院、云南大学药学院等多家单位合作完成，通讯作者为Weilie Xiao、Shengce Tao、Lili Zhu和Honglin Li。论文发表于 *Science China Life Sciences*，于2024年6月17日收稿，2024年8月7日接受。
一、学术背景
近年来，以程序性死亡受体1（programmed death-1，PD-1）及其配体程序性死亡受体配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）为靶点的免疫检查点抑制剂在肿瘤治疗中取得了显著成功。PD-1主要表达于活化的免疫细胞表面，而PD-L1广泛表达于多种肿瘤细胞表面。当PD-L1与PD-1结合后，PD-1胞内段的免疫受体酪氨酸转换基序（immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM）在Y248位点发生磷酸化，为含Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2（SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2，SHP-2）的SH2结构域提供停靠位点，从而招募SHP-2，最终抑制T细胞增殖和细胞因子分泌，导致T细胞耗竭和免疫逃逸。
目前已有多种靶向PD-1/PD-L1的单克隆抗体获批上市，如Keytruda和Tecentriq，但抗体药物存在免疫原性强、肿瘤组织渗透性差、给药不便等不足。因此，开发能够阻断PD-1信号通路的小分子抑制剂具有重要意义。天然产物因毒性低、来源丰富，成为新药发现的重要资源。本研究从实验室自建的天然化合物库中筛选得到一个五环三萜类天然产物——pygenic acid A（PA），并系统研究了其抗肿瘤活性、免疫调节功能及分子机制。
二、研究流程与实验方法
研究首先采用PD-1/PD-L1免疫检查点阻断细胞实验筛选内部天然化合物库。该实验使用稳定表达PD-L1和CD3L的CHO-PD-L1-CD3L细胞与稳定表达PD-1和NFAT-荧光素酶报告基因的Jurkat-PD-1-NFAT细胞共培养。阻断PD-1/PD-L1通路的化合物可恢复TCR介导的Jurkat细胞活化，使荧光素酶表达增加。初筛发现PA的荧光素酶表达水平最高。进一步的IL-2分泌实验显示，PA、Keytruda和Tecentriq均能增加IL-2分泌，提示PA可能通过阻断PD-1/PD-L1通路恢复T细胞活化状态。
在体内实验中，研究者使用人PD-1基因敲入的C57BL/6小鼠（hPD-1 knock-in C57BL/6 mice）建立MC38同源肿瘤模型。荷瘤小鼠分别接受PBS、PA（10 mg/kg，每日一次，口服）或Keytruda（1 mg/kg，每周两次，腹腔注射）治疗24天。通过肿瘤体积、肿瘤重量、体重变化以及肿瘤组织中CD8阳性细胞浸润等指标评估PA的抗肿瘤活性。同时，免疫组化检测CD8表达，H&E染色评估主要脏器毒性。为分析PA的体内抗肿瘤活性是否依赖T淋巴细胞，还在免疫缺陷BALB/c裸鼠中评价了PA对MC38肿瘤生长的影响。
机制研究方面，研究者对hPD-1敲入C57BL/6小鼠的MC38肿瘤组织进行了RNA测序，分析差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），并通过基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析探讨PA对免疫相关通路的影响。进一步利用Jurkat-PD-1-NFAT细胞进行qPCR和Western blot验证，检测IRF1、STAT1、IRF9、IFNG、GZMB和PRF1等基因的表达，以及STAT1和ERK的磷酸化水平。
为确认PA的直接作用靶点，研究首先通过竞争性ELISA和流式细胞术排除PA直接阻断PD-1/PD-L1结合或下调PD-1/PD-L1表达的可能。随后合成了生物素化的PA探针（biotin-PA），利用特异性Pup化作为身份报告子（specific pupylation as identity reporter，SPIDER）技术捕获并鉴定PA的靶蛋白，共富集到72个蛋白，其中SHP-2与T细胞活化和PD-1信号抑制高度相关。通过CRISPR-Cas9技术构建SHP-2敲除的Jurkat-PD-1-NFAT细胞，在SHP-2敲除细胞中PA无法进一步增加荧光素酶表达，证明PA通过靶向SHP-2抑制PD-1信号转导。采用pull-down实验、药物亲和反应靶稳定性（drug affinity responsive target stability，DARTS）实验和表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）实验验证PA与SHP-2的直接结合。此外，使用DiFMUP底物检测PA对SHP-2磷酸酶活性的影响，结果表明PA不抑制SHP-2的磷酸酶活性，提示其结合模式不同于已报道的正构抑制剂PHPS1和变构抑制剂SHP099。
进一步通过SPR测定PA与SHP-2的PTP结构域和SH2结构域的结合能力，发现PA仅与SH2结构域结合。分子对接预测PA在N-SH2和C-SH2结构域中的结合模式，并通过定点突变（R32A、R138A及R138A-S140A-Q141A突变体）验证关键结合残基。100 ns分子动力学模拟评估PA/C-SH2复合物的稳定性。采用竞争性ELISA和免疫共沉淀实验检测PA是否阻断SHP-2与PD-1磷酸化ITSM肽段以及PD-1与SHP-2在细胞内的相互作用。
三、主要研究结果
体外筛选结果显示，PA能显著恢复Jurkat-PD-1-NFAT细胞的荧光素酶表达，并增加IL-2分泌，且效果与Keytruda和Tecentriq相当。体内实验表明，PA和Keytruda均能显著抑制MC38肿瘤的生长，肿瘤体积和肿瘤重量均低于PBS对照组，同时未观察到明显体重变化或主要脏器损伤。PA处理组肿瘤组织中CD8阳性细胞浸润显著增加，提示细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）浸润增强。在免疫缺陷BALB/c裸鼠中，PA不能减缓MC38肿瘤生长，证明PA的体内抗肿瘤活性依赖于T细胞的效应功能。
RNA测序结果显示，PA处理组有252个基因上调、192个基因下调，其中STAT1、IFNG和IRF1等干扰素信号通路相关基因显著上调。GO富集分析提示PA促进免疫炎症因子转录和干扰素相关通路激活。qPCR和Western blot结果进一步证实，PA能够逆转PD-L1-Fc蛋白对IRF1、STAT1、IRF9、IFNG、GZMB和PRF1等基因表达的抑制，并恢复STAT1和ERK的磷酸化水平，表明PA通过破坏PD-1信号转导促进免疫应答。
在人原代T细胞实验中，PA可恢复PD-L1-Fc抑制的CD3阳性T细胞分泌IFN-γ和IL-2，并剂量依赖性地恢复CD4阳性和CD8阳性T细胞的增殖。PA还能增加CD8阳性T细胞分泌颗粒酶B和穿孔素，增强CTL对A375、A549和HeLa等PD-L1高表达肿瘤细胞的杀伤作用，但对这些肿瘤细胞本身无明显直接抑制作用。上述结果表明PA通过抑制PD-1信号恢复T细胞的效应功能。
靶点鉴定结果显示，PA不能直接阻断PD-1与PD-L1的结合，也不能下调PD-1或PD-L1的表达。SPIDER实验富集到SHP-2，SHP-2敲除细胞实验证实PA的作用依赖于SHP-2。SPR测得PA与SHP-2的解离常数（Kd）为0.86±0.78 μmol/L，与SH2结构域的Kd为2.24±0.70 μmol/L，与PTP结构域无结合。PA不抑制SHP-2磷酸酶活性。定点突变实验表明R138A及R138A-S140A-Q141A突变显著破坏PA与SHP-2的结合，而R32A突变仅略微降低亲和力，说明Arg138、Ser140和Asn141是PA与SHP-2结合的关键残基。分子动力学模拟显示，Arg138突变后PA不能稳定结合在磷酸化肽段结合位点。竞争性ELISA和免疫共沉淀实验表明，PA可阻断SHP-2与PD-1磷酸化ITSM肽段的结合，并剂量依赖性地抑制细胞内PD-1与SHP-2的相互作用。综合这些结果，研究证明PA通过占据SHP-2的磷酸化ITSM识别位点，阻断PD-1招募SHP-2，从而抑制PD-1信号转导。
四、结论与意义
本研究鉴定出天然五环三萜类化合物PA作为一种新型PD-1信号抑制剂，并首次发现PA可直接结合SHP-2的磷酸化ITSM识别位点，阻断PD-1与SHP-2的相互作用。不同于已报道的SHP-2正构或变构抑制剂，PA不抑制SHP-2的磷酸酶活性，而是通过占据一个新的可成药位点发挥作用。该研究不仅为肿瘤免疫治疗提供了一个有潜力的候选分子，也为开发靶向PD-1信号通路的小分子抑制剂提供了新策略，即通过占据SHP-2的磷酸化ITSM识别位点来阻断PD-1信号转导。此外，本研究利用SPIDER技术成功实现天然产物靶点的识别与验证，为天然产物靶标确认提供了范例。
五、研究亮点
本研究的亮点在于：一是从天然产物中发现具有免疫调节活性的PD-1信号抑制剂PA，并在体内外系统验证其抗肿瘤活性及免疫激活功能；二是首次揭示PA通过结合SHP-2的磷酸化ITSM识别位点阻断PD-1/SHP-2相互作用的新机制，发现了一个不同于已有SHP-2抑制剂结合位点的全新可成药口袋；三是成功运用SPIDER等一系列靶点识别和验证技术，为天然产物靶标鉴定提供了可借鉴的研究路径。