这份研究由来自京都大学研究生院医学研究科创新免疫调节技术与治疗学中心、大阪大学WPI免疫学前沿研究中心以及Astellas制药公司药物探索研究部等多个机构的Masahiko Akamatsu、Norihisa Mikami、Shimon Sakaguchi等学者共同完成，并于2019年10月25日发表于《Science Immunology》杂志。

学术背景与目的 该研究属于免疫调节领域，核心关注点是调控性T细胞（Regulatory T cells, Treg）的生成与功能。Foxp3是Treg细胞的关键转录因子，对于维持免疫耐受和稳态至关重要。Foxp3+ Treg细胞的数量或功能缺陷会导致自身免疫病、过敏等多种免疫疾病。因此，诱导生成抗原特异性的、功能稳定的Foxp3+ Treg细胞，特别是能将介导疾病的效应/记忆T细胞转化为Treg细胞，是治疗相关疾病极具前景的策略。

传统上，在体外利用转化生长因子-β（Transforming growth factor–β, TGF-β）可以在抗原刺激下将初始常规T细胞（conventional T cells, Tconv）诱导为Foxp3+细胞，即诱导性Treg细胞（induced Treg, iTreg）。然而，这种方法存在明显局限：1）只能从初始T细胞诱导，无法转化已分化的效应或记忆T细胞；2）诱导过程会被促炎细胞因子（如IL-4, IL-6, IFN-γ）抑制；3）所生成的iTreg细胞在体内功能不稳定，缺乏Treg特异的表观遗传修饰，限制了其治疗应用。

基于这些背景，本研究旨在寻找一种新型小分子化合物，能够克服上述局限，即在TGF-β非依赖、甚至存在炎症因子的条件下，将初始以及效应/记忆Tconv细胞转化为功能稳定的Foxp3+ Treg细胞，并探讨其在治疗自身免疫和过敏性疾病中的应用潜力。

详细研究流程 本研究流程复杂，涉及多个阶段，可概括如下： 1. 化合物筛选与初步鉴定：研究团队首先从约5000种结构各异的小分子化合物库中筛选能够在T细胞受体（TCR）多克隆刺激下，诱导Tconv细胞表达Foxp3的化合物。他们发现化合物AS2863619（后简称AS）能有效诱导小鼠和人的初始CD4+及CD8+ T细胞表达Foxp3。关键的是，AS的诱导不依赖于外源TGF-β（在TGF-β中和抗体或无血清条件下依然有效），且不受Th1、Th2、Th17或Th9等促炎条件培养基的抑制。更重要的是，AS能够诱导表型为效应/记忆型（CD44high CD62Llow）的Tconv细胞表达Foxp3，这是TGF-β无法做到的。AS诱导的Foxp3+细胞表达典型的Treg表面分子（如CD25, CTLA-4, GITR），并具备体外抑制功能。此外，AS诱导需要抗原刺激（使用DO11.10 TCR转基因T细胞和卵清蛋白OVA肽证实）和IL-2的参与。 2. 靶点分子鉴定：为了确定AS的作用靶点，研究者使用了化学蛋白质组学方法。他们将一种活性的AS类似物（AS3309191）与光反应性亲和捕获接头偶联，与小鼠EL4 T细胞淋巴瘤裂解液共孵育，通过亲和纯化结合质谱分析，鉴定出潜在的结合蛋白。结果显示，周期蛋白依赖性激酶8和19（Cyclin-dependent kinase ⁸⁄₁₉, Cdk8/19），以及糖原合酶激酶3α/β（GSK3α/β）是候选靶点。随后，通过比较AS及其类似物、已知的CDK8/19抑制剂（Senexin A）和GSK3抑制剂（CHIR99021）对Foxp3的诱导能力及其对相应激酶的抑制活性，发现Foxp3诱导效力与抑制CDK8/19的活性高度相关，而与抑制GSK3的活性无关。此外，选择性更强的CDK8/19抑制剂AS3334366是更高效的Foxp3诱导剂，且在189种激酶的选择性分析中，其对GSKs和RSKs等激酶抑制很弱。这些证据强烈指向CDK8/19是AS诱导Foxp3的关键靶点。 3. 基因水平验证靶点功能：研究进一步在基因层面验证CDK8/19的作用。RNA干扰敲低CDK8或CDK19，均能在TCR刺激后显著增加Foxp3的mRNA表达。在CD4+ Tconv细胞中过表达激酶死亡型（kinase-dead, KD）突变体CDK8或CDK19（起显性负性作用），可在无TGF-β或存在IL-6的条件下诱导Foxp3表达，而过表达野生型则不能。利用CRISPR-Cas9技术构建的CDK8和/或CDK19基因敲除（KO）的EL4细胞系进行荧光素酶报告基因实验表明，AS能增强Foxp3启动子活性，但在CDK8/19双敲除细胞中无效。体内实验也证实，将过表达KD-CDK8的DO11.10 TCR+ CD4+ T细胞过继转移到裸鼠体内，经抗原OVA免疫后，能产生Foxp3+ T细胞，而过表达野生型CDK8则不能。这些结果确证了CDK8/19在生理上抑制活化Tconv细胞中Foxp3的表达，而抑制其活性足以诱导Foxp3。 4. 机制探索：与STAT5的相互作用：鉴于IL-2/STAT5信号对Foxp3诱导很重要，且CDK8已知可磷酸化STAT蛋白的丝氨酸残基，研究者探讨了AS是否通过调节STAT5起作用。免疫共沉淀实验显示，在活化的CD4+ T细胞中，CDK8与STAT5b存在相互作用。体外激酶实验证明，重组野生型CDK8能磷酸化STAT5b的丝氨酸位点（S731），而KD-CDK8不能，且AS能抑制该磷酸化。在活化的T细胞中，AS处理抑制了STAT5b丝氨酸位点的磷酸化（降至对照的~40%），同时增强了其酪氨酸位点（Y694）的磷酸化（增至对照的~160%）。邻近连接实验和免疫荧光共定位证实了内源性CDK8与STAT5在活化T细胞中的相互作用。过表达丝氨酸磷酸化位点突变体（S730A-STAT5b，模拟了AS的作用效果）能更有效地诱导Foxp3，且AS处理能使野生型STAT5b的诱导效果达到与突变体相当的水平。这些结果表明，AS通过抑制CDK8/19，减少STAT5的丝氨酸磷酸化，增强其酪氨酸磷酸化及活化，进而促进Foxp3等基因的转录。 5. 全基因组水平解析机制：通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析，研究者发现AS处理增强了STAT5在全基因组范围内与增强子区域的结合，特别是在Foxp3基因座的CNS0增强子区域，以及启动子和CNS2区域。STAT5结合增强的位点主要位于内含子和基因间区（增强子区域），这些区域相关基因的表达被AS显著上调，包括Foxp3、Il2ra、Tnfrsf18等Treg特征基因。而STAT5结合未变化的位点主要位于启动子区，其相关基因表达未受明显影响。这表明AS通过增强STAT5在增强子区域的结合，特异性上调Treg相关基因的表达。 6. 体内诱导抗原特异性pTreg及功能稳定性评估：在DO11.10 TCR转基因且缺乏胸腺来源Treg（Rag2缺陷）的小鼠中，口服AS并给予OVA免疫，能够在抗原特异性（KJ1-26+）T细胞中诱导产生Foxp3+细胞。RNA-seq分析显示，这些AS在体内诱导的周边诱导性Treg（peripherally induced Treg, pTreg）细胞的基因表达谱更接近于自然Treg（nTreg），特别是活化的nTreg。与体外AS诱导的iTreg不同，体内诱导的pTreg细胞获得了稳定的Treg特异性DNA去甲基化状态（在Foxp3 CNS2、Helios等基因座），并且低表达神经纤毛蛋白-1（neuropilin-1, Nrp1）和整合素β8，这些是pTreg的特征。同时，它们高表达KLRG1，提示处于高度分化/活化状态。这些pTreg细胞在体外表现出与nTreg相当的强效抑制功能。 7. 疾病模型中的治疗效应验证：研究在多个动物疾病模型中评估了AS的治疗效果。在皮肤接触性超敏反应（CHS）模型中，致敏后给予AS治疗能减轻二次攻击的耳肿胀和炎症细胞浸润，并增加引流淋巴结中KLRG1+ Foxp3+ T细胞的比例；若在攻击前用白喉毒素清除Foxp3+细胞，则AS的保护作用消失，证明其疗效依赖于Treg。在非肥胖糖尿病（NOD）小鼠模型中，AS治疗显著降低了糖尿病的发病率，减轻了胰岛炎，并伴有淋巴结中KLRG1+ Foxp3+ T细胞比例升高和Th1细胞比例下降。在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中，AS治疗改善了临床症状，减少了脊髓病理损伤，同时增加KLRG1+ Foxp3+ T细胞并减少Th17细胞。

主要结果 1. 发现新型Foxp3诱导剂AS：AS能在TGF-β非依赖、炎症因子存在下，诱导初始及效应/记忆CD4+和CD8+ T细胞表达Foxp3，生成具有抑制功能的iTreg细胞。 2. 确定CDK8/19为关键靶点：化学生物学和遗传学实验一致证明，AS通过抑制CDK8和CDK19的激酶活性来诱导Foxp3。CDK8/19在生理上负向调控活化Tconv细胞中的Foxp3表达。 3. 阐明核心分子机制：AS抑制CDK8/19，导致STAT5的丝氨酸磷酸化减弱、酪氨酸磷酸化增强，从而促进活化的STAT5与Foxp3等基因的增强子区域（特别是CNS0）结合，驱动其转录。 4. 证实体内生成功能性稳定pTreg：AS与抗原刺激联用，可在体内将抗原特异性Tconv细胞转化为Foxp3+ pTreg细胞。这些细胞不仅获得了稳定的Treg表观遗传特征和强大的抑制功能，还表现出KLRG1高表达等分化特征。 5. 验证治疗潜力：在CHS、自发性糖尿病（NOD）和EAE等小鼠模型中，AS治疗通过诱导抗原特异性pTreg（尤其是KLRG1+亚群），有效抑制了病理性免疫反应，缓解了疾病症状。

结论与意义 本研究得出结论：CDK8/19是活化常规T细胞中Foxp3表达的生理性抑制因子。药理性抑制CDK8/19（或基因敲低/敲除）能够通过增强STAT5活化，将抗原特异性效应/记忆T细胞以及初始T细胞转化为Foxp3+ Treg细胞。这种诱导不依赖于TGF-β，且不受炎症环境干扰。体内诱导产生的抗原特异性pTreg细胞功能稳定，并能在多种自身免疫和过敏性疾病模型中发挥治疗作用。

该研究的科学价值在于：1）揭示了CDK8/19-STAT5轴是调控T细胞Foxp3表达和Treg分化的一个新关键通路，深化了对周边免疫耐受机制的理解；2）提供了一种全新的、克服传统TGF-β诱导法局限性的Treg细胞诱导策略。其应用价值巨大：为治疗自身免疫病、过敏、移植排斥等免疫性疾病提供了新的潜在药物靶点（CDK8/19）和先导化合物（AS及其类似物），使得“将致病性T细胞改造为抑制性T细胞”的转化医学设想更具可行性。

研究亮点 1. 靶点与机制新颖：首次发现并证实CDK8/19是Foxp3表达的生理性抑制因子，并阐明其通过调节STAT5磷酸化状态发挥作用的分子机制。 2. 突破传统局限：所开发的方法（CDK8/19抑制）能够在TGF-β非依赖、炎症环境下，将难以调控的效应/记忆T细胞转化为Treg，这是该领域的一个重要突破。 3. 功能稳定性：体内诱导的pTreg细胞获得了稳定的表观遗传修饰和强大的抑制功能，解决了体外诱导iTreg细胞不稳定的关键难题。 4. 转化潜力明确：在多个临床前疾病模型中证实了治疗效果，并将治疗效应与抗原特异性KLRG1+ pTreg细胞的生成直接关联，为后续药物开发奠定了坚实基础。 5. 跨学科方法：综合运用了高通量筛选、化学生物学靶点鉴定、遗传操作、表观基因组学（ChIP-seq, ATAC-seq, RNA-seq）和多种疾病模型，研究体系完整、证据链坚实。

其他有价值内容 研究还发现，AS与TGF-β在诱导Foxp3上有协同作用，提示CDK8/19和TGF-β信号通路虽然不同，但可能汇聚于Foxp3基因的激活。此外，研究观察到即使在没有外源抗原免疫的小鼠中，AS治疗也能增加一定比例的Foxp3+ T细胞（主要为KLRG1-），提示AS可能通过影响DC呈递自身抗原或直接作用于某些自身反应性T细胞，诱导了调节性细胞，这为理解其潜在的广谱免疫调节作用提供了线索。这些发现都值得在未来进一步探究。