本研究由东北大学理学院化学系的秦雨欣、陆慧颖、舒杨及王建华等人完成，其中舒杨为通讯作者。该研究成果发表于《ACS Applied Materials & Interfaces》期刊，于2025年3月27日在线发表，论文题名为《Atovaquone-Coordinated Copper-Polyphenol Nanoplatform Orchestrates Dual Metabolic Interference for Synergistic Cuproptosis and Apoptosis》。

该研究属于纳米医学与肿瘤代谢治疗领域。铜死亡（cuproptosis）是一种新发现的铜依赖性细胞死亡机制，其核心在于细胞内过量铜离子直接结合三羧酸循环中的二氢硫辛酰胺转乙酰基酶（DLAT），导致DLAT蛋白聚集及铁硫簇（Fe–S cluster）蛋白丢失，引发蛋白质毒性应激并最终导致细胞死亡。然而，肿瘤微环境（TME）中高浓度的谷胱甘肽（GSH）可螯合铜离子从而降低铜毒性，同时缺氧条件下肿瘤细胞的代谢适应也会削弱铜死亡疗效。此外，氧化磷酸化（OXPHOS）在多种肿瘤中上调以维持其能量供应，且铁硫簇蛋白是电子传递链复合物I–III的关键组分。现有铜死亡治疗策略多集中于铜离子递送，忽略了铁硫簇的自我修复能力及缺氧肿瘤中氧化磷酸化的代偿活性。因此，本研究旨在构建一种能够同时靶向铁硫簇完整性与线粒体呼吸的纳米平台，通过“双重代谢干扰”策略增强铜死亡与凋亡的协同抗肿瘤效果。

研究团队设计了以铜-紫草素（shikonin，SK）配位网络（CuSK）为基础、负载氧化磷酸化抑制剂阿托伐醌（atovaquone，ATO）并由透明质酸（HA）表面功能化的肿瘤微环境响应性纳米平台（ACH NPs）。首先，通过将聚乙烯吡咯烷酮、氯化铜溶液与紫草素乙醇溶液在室温下混合搅拌制备CuSK纳米颗粒，随后在冰浴条件下负载ATO形成AC NPs，最后将AC NPs与HA溶液搅拌过夜得到ACH NPs。对纳米平台的表征包括透射电子显微镜观察形貌、紫外-可见光谱分析配位作用、傅里叶变换红外光谱验证官能团变化、zeta电位监测制备过程、X射线光电子能谱确认铜价态及元素组成、高效液相色谱测定ATO负载率。密度泛函理论计算揭示了ATO与CuSK之间通过π–π堆叠相互作用的分子识别机制，结合能为−570.998 kcal/mol，原子间距为3.5–3.9 Å。在体外药物释放实验中，研究者考察了不同pH及GSH条件下ATO、SK和铜离子的累积释放行为，并通过Ellman试剂、浴铜灵二磺酸二钠盐、电子自旋共振及亚甲基蓝降解实验验证了ACH NPs对GSH的消耗、Cu⁺的生成以及羟基自由基（•OH）的产生能力。细胞实验以小鼠乳腺癌4T1细胞和小鼠乳腺上皮HC11细胞为研究对象，通过共聚焦显微镜和流式细胞术评估细胞摄取效率，利用CCK-8法测定细胞活力，采用Calcein-AM/PI染色和Annexin V-FITC/PI流式检测评估细胞死亡方式。机制研究部分检测了细胞内GSH水平、活性氧（ROS）生成、线粒体复合物III活性、培养基溶解氧变化、ATP含量、线粒体膜电位（JC-1染色）、铜死亡相关蛋白FDX1与DLAT的表达及聚集情况、凋亡相关蛋白caspase-3的表达、以及缺氧诱导因子HIF-1α的水平，并通过铜死亡抑制剂UK-5099预处理验证铜死亡在细胞死亡中的贡献。体内实验采用4T1荷瘤小鼠模型，将小鼠随机分为PBS对照组、CH NPs组和ACH NPs组（每组5只），通过尾静脉注射给药4次，每2天测量肿瘤体积和小鼠体重，治疗14天后处死小鼠，收集肿瘤及主要脏器进行称重、苏木精-伊红染色、免疫荧光检测DLAT和HIF-1α表达，并通过电感耦合等离子体质谱测定不同时间点各组织中的铜含量以评估生物分布，同时进行血液学、血液生化及溶血实验评价生物安全性。

研究结果显示，ACH NPs呈球形，粒径约50 nm，水合粒径约66.2 nm，且在7天内保持稳定。XPS证实同时存在Cu⁺和Cu²⁺物种，ATO的最佳负载率为15.6%。药物释放实验表明，在pH 6.5且GSH浓度为5 mM条件下，ATO在24小时内累积释放达71.8%，SK释放84.0%，铜离子释放89.8%，而在pH 7.4条件下释放率均低于约16%。ESR和亚甲基蓝降解实验证实ACH NPs在酸性GSH环境中能高效催化过氧化氢生成羟基自由基。细胞实验表明，ACH NPs对4T1细胞具有浓度依赖性的杀伤作用，45 μg/mL浓度下细胞存活率降至11.9%，而对HC11正常细胞无显著毒性；流式检测显示ACH NPs组晚期凋亡/坏死细胞比例达52.6%，显著高于CH NPs组的32.9%及对照组的4.77%。机制研究证实，ACH NPs处理可消耗细胞内GSH、显著升高ROS水平；线粒体复合物III活性由CH组的67.5%降至ACH组的34.7%，培养基溶解氧消耗量从PBS组的1.4 mg/mL降至ACH组的0.4 mg/mL，ATP含量显著下降；JC-1染色显示ACH NPs导致明显的线粒体膜电位崩溃；Western blot显示FDX1表达下降、caspase-3表达降低（ACH组为对照组的40.1%）、HIF-1α表达降低（ACH组为对照组的66.7%）；免疫荧光可见ACH组DLAT聚集点明显增多；UK-5099预处理可使ACH组细胞存活率从12.61%恢复至47.97%，证明铜死亡在整体细胞死亡中的贡献。体内实验显示，ACH NPs治疗组肿瘤抑制率达86.8%，显著高于CH NPs组的45.0%，且小鼠体重无明显变化；铜生物分布显示注射后24小时肿瘤组织铜含量高达19.34% ID/g。H&E染色可见ACH组肿瘤组织出现大面积坏死，免疫荧光证实DLAT聚集增强及HIF-1α表达降低。主要脏器H&E染色、血液学及生化指标均未见明显异常，溶血实验亦表明所用浓度下无溶血现象。

本研究得出以下结论：ACH NPs通过铜驱动的DLAT聚集与ATO介导的OXPHOS抑制实现了对线粒体能量代谢的双重干扰，有效克服了GSH依赖的铜解毒和缺氧诱导的耐药；同时Cu⁺催化的类芬顿反应与紫草素驱动的氧化应激协同产生ROS并激活caspase-3依赖性凋亡。该工作不仅拓展了铜死亡治疗的理论边界，还为通过协调靶向金属稳态与代谢脆弱性进行癌症治疗提供了有前景的范式。

本研究的亮点包括：首次将线粒体呼吸抑制剂ATO引入铜基纳米平台，通过抑制复合物III活性降低细胞耗氧率并阻断ATP合成，从根源上改善肿瘤缺氧并增强铜死亡敏感性；构建了基于铜-紫草素金属酚网络的TME响应性纳米载体，实现GSH/酸触发下的程序化解体与药物释放；体外与体内实验系统验证了“铜死亡-凋亡”协同机制，肿瘤抑制率高达86.8%，且具备良好的生物安全性。此外，密度泛函理论计算揭示了ATO与CuSK之间通过π–π堆叠的分子识别机制，为纳米平台的合理设计提供了理论依据。