关于UPP1/2介导的尿苷/RNA核糖拯救在营养限制条件下支持糖酵解研究的学术报告
本报告旨在向中文科研同仁系统介绍一项发表于Nature Metabolism的重要研究成果。该研究由来自多个顶尖研究机构的学者共同完成，包括美国哈佛医学院、麻省总医院、瑞士洛桑大学、日本金泽大学等。第一作者为Owen S. Skinner和Joan Blanco-Fernández，通讯作者为Vamsi K. Mootha和Alexis A. Jourdain。该研究于2023年5月在线发表于Nature Metabolism期刊。
一、 学术背景
葡萄糖是细胞生命活动的主要能源和碳骨架来源。然而，在生理或病理条件下（如肿瘤微环境、缺血、特定疾病状态），细胞可能面临葡萄糖供应不足的挑战。此时，细胞必须利用替代营养物质维持生存。既往研究表明，在氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation, OxPhos）缺陷的细胞中，补充尿苷（Uridine）可以支持嘧啶核苷酸的合成，但其在能量代谢中的作用一直未被明确认知。尽管有零星报道提及尿苷在葡萄糖缺乏时对细胞（如神经元）有保护作用，其具体机制，特别是尿苷能否直接作为能量底物，尚不清晰。本研究旨在系统探索细胞在完全缺乏葡萄糖条件下的耐受机制，并鉴定新的替代性能量来源途径。
二、 详细工作流程
本研究采用了一种多层次的系统生物学策略，结合了功能基因组学筛选、代谢组学、转录组学分析和体内外验证。
流程一：基于过表达文库的营养敏感性筛选。 研究团队首先在K562细胞（一种人类慢性髓系白血病细胞系）中进行了全基因组范围的过表达筛选。他们使用了一个包含17,255个条形码标记的开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）的文库。细胞被置于含有葡萄糖或半乳糖（一种糖酵解效率较低的糖）的培养基中培养21天。培养基中还含有丙酮酸和尿苷，以满足OxPhos缺陷细胞的基本需求。通过下一代测序（Next-Generation Sequencing）分析不同条件下条形码的丰度变化，他们发现，在半乳糖条件下，四个线粒体丙酮酸脱氢酶激酶（PDK1-4）的ORF均被耗竭（这与它们抑制氧化代谢的功能一致），而两个尿苷磷酸化酶（Uridine Phosphorylase）UPP1和UPP2的ORF却显著富集。这提示UPP1/2的高表达可能赋予细胞在非优选糖条件下生长的优势。
流程二：UPP1/2功能验证与底物特异性分析。 为验证筛选结果，研究者在K562细胞中稳定表达了UPP1或UPP2。结果证实，表达UPP1/2的细胞在半乳糖培养基中的增殖能力显著增强，且这种增强严格依赖于培养基中尿苷的存在。更重要的是，这些细胞甚至可以在完全不含葡萄糖或半乳糖（即“无糖”）的培养基中，仅依靠尿苷实现有效增殖，而对照细胞则不能。进一步的测试表明，只有尿苷能支持这种生长，其他七种核酸核苷酸前体均不能替代。研究还发现，培养基中的RNA（经RNA酶作用可释放尿苷）同样可以以UPP1依赖的方式支持细胞在无糖条件下的生长，并且UPP1表达细胞内尿苷水平降低，表明发生了UPP1介导的分解代谢。
流程三：基于CRISPR-Cas9敲除文库的机制解析筛选。 为了深入探究尿苷支持生长的分子机制，研究者在表达UPP1的K562细胞中进行了全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选，比较细胞在葡萄糖与尿苷条件下的必需基因谱。这一关键筛选揭示了三个在尿苷条件下差异必需的基因类别：1) 从头嘧啶合成途径（CAD， DHODH， UMPS）的基因在葡萄糖条件下必需，但在尿苷条件下变得非必需，这符合尿苷作为嘧啶补救合成底物的预期。2) 磷酸戊糖途径（Pentose Phosphate Pathway， PPP）的非氧化分支（Non-oxidative PPP）的核心基因（PGM2， TKT， RPE）在尿苷条件下显示出高度必需性。其中，PGM2（将核糖-1-磷酸（Ribose-1-phosphate， R1P）转化为核糖-5-磷酸）是连接UPP1/2反应与PPP的关键酶。3) 数个糖酵解上段（Upper Glycolysis）的酶（如由ALDOA， GPI， HK2编码的酶）在葡萄糖条件下必需，但在尿苷条件下变得非必需。这一系列结果强烈暗示，尿苷分子的核糖部分可能通过UPP1/2分解产生R1P，进而经非氧化PPP转化为果糖-6-磷酸（F6P）和甘油醛-3-磷酸（G3P），从而绕过糖酵解上段（如葡萄糖转运和己糖激酶步骤），直接进入糖酵解下段（Lower Glycolysis）为细胞提供能量和生物合成前体。
流程四：代谢通量分析与体内验证。 为直接证实上述假说，研究者进行了代谢示踪实验。他们使用碳-13（¹³C）全标记的尿苷（¹³C₅-Uridine，标记位点在核糖环上）处理细胞。液相色谱-质谱联用（Liquid Chromatography–Mass Spectrometry， LC–MS）分析显示，在表达UPP1的细胞中，¹³C标记广泛出现在PPP、糖酵解（包括上段和下段）中间产物以及乳酸中，三羧酸循环（Tricarboxylic Acid Cycle， TCA）中间产物（如柠檬酸）也出现了部分标记。而在对照细胞中标记掺入极少。这直接证明了尿苷衍生的核糖碳原子进入了中心碳代谢流。 为进一步验证该通路的生理相关性，研究者在禁食小鼠体内进行了¹³C₅-尿苷腹腔注射示踪。30分钟后，在小鼠肝脏和循环代谢物中检测到了¹³C在核糖磷酸、糖酵解中间产物及葡萄糖中的掺入，表明该通路在活体动物中同样存在，并且尿苷衍生的碳原子可以用于糖异生（Gluconeogenesis）。
流程五：肿瘤细胞系普查与表达调控研究。 为了解利用尿苷核糖进行糖酵解的能力在人类细胞中是否普遍存在，研究者利用PRISM集合（包含482个条形码标记的贴壁肿瘤细胞系，涵盖22种实体瘤谱系）进行了大规模筛选。结果显示，黑色素瘤（Melanoma）和神经胶质瘤（Glioma）细胞系在尿苷培养基中生长能力显著强于其他谱系，而尤文肉瘤（Ewing Sarcoma）细胞系则较弱。基因组学关联分析发现，跨细胞系水平，生长能力与UPP1的mRNA表达水平、蛋白丰度以及基因拷贝数变异呈最强正相关。在黑色素瘤细胞中进行的基因敲除实验证实，内源性UPP1的表达是其在无糖尿苷培养基中生长所必需且充分的。 研究进一步探讨了UPP1的表达调控。生物信息学分析和实验验证表明，在黑色素瘤中，转录因子MITF能够结合UPP1基因的启动子区域并促进其表达，从而增强细胞利用尿苷的能力。
流程六：免疫细胞中的通路验证与调控。 鉴于UPP1在免疫细胞中高表达，研究者探索了该通路在巨噬细胞中的作用。他们发现，在人单核细胞THP1向巨噬细胞分化/极化过程中、在人外周血单核细胞来源的巨噬细胞以及小鼠骨髓来源巨噬细胞中，UPP1的表达会随着分化或免疫刺激（如LPS、RNA、TLR7/8激动剂R848）而显著上调。同时，¹³C₅-尿苷在柠檬酸和乳酸中的掺入标记也随之增加。这表明巨噬细胞具有利用尿苷核糖进行糖酵解的能力，并且该能力在细胞激活状态下可被进一步诱导，提示其在免疫应答等能量需求高的过程中可能具有重要作用。
流程七：通路调控特性研究。 一个有趣的发现是，与葡萄糖支持的糖酵解不同，由尿苷衍生的核糖支持的糖酵解似乎不受急性调控。当使用寡霉素（Oligomycin）抑制OxPhos时，葡萄糖培养细胞的糖酵解速率（通过细胞外酸化率（Extracellular Acidification Rate， ECAR）测量）会立即大幅增加（即“帕斯蒂尔效应” Pasteur Effect的反向调节），但尿苷培养细胞的ECAR则不受此调控。此外，即使在葡萄糖浓度饱和、乳酸产量达到平台的情况下，尿苷向乳酸中的掺入也不受影响。这表明尿苷作为底物，通过绕过葡萄糖转运和上段糖酵解这两个关键调控点，以一种“组成型”的方式进入代谢流。
三、 主要结果
这些结果环环相扣：从表型筛选（流程一、二）发现现象，到机制筛选（流程三）提出假说，再到代谢示踪（流程四）直接验证假说，最后通过谱系普查（流程五）和免疫细胞研究（流程六）证实其广泛生理病理意义，并辅以调控特性分析（流程七）揭示其独特之处，构成了一个完整严谨的证据链。
四、 研究结论与意义
本研究首次系统阐明并证明了在葡萄糖缺乏条件下，细胞可以通过“尿苷分流”（Uridine Bypass）途径获取能量和碳源。其核心机制是：尿苷（或RNA来源的尿苷）在尿苷磷酸化酶UPP1/2催化下分解为尿嘧啶和核糖-1-磷酸（R1P）；R1P经磷酸葡萄糖变位酶PGM2转化为核糖-5-磷酸，进入PPP的非氧化分支；最终生成果糖-6-磷酸（F6P）和甘油醛-3-磷酸（G3P），从而绕过高度受调控的糖酵解上段（葡萄糖转运及磷酸化），直接注入糖酵解下段，支持ATP生成、生物合成以及糖异生。
科学价值： 1. 拓展了细胞能量代谢的认知：确立了尿苷（及RNA）作为替代性能量底物的重要地位，揭示了一条此前被忽视的、独立于葡萄糖的糖酵解补给途径。 2. 连接了核苷酸代谢与中心碳代谢：打破了传统上认为核苷酸主要参与生物大分子合成的观念，揭示了其分解产物（核糖）可直接参与产能代谢，提供了核苷酸库与能量状态之间新的联系。 3. 提供了新的疾病机制视角：该通路在特定肿瘤（如黑色素瘤、胶质瘤）和激活的免疫细胞中高度活跃，提示其可能在肿瘤代谢重编程和免疫细胞功能中扮演重要角色，为相关疾病的治疗提供了潜在新靶点（如UPP1）。 4. 解释了临床观察与潜在风险：研究提出的“组成型”代谢输入特性，为解释高尿苷饮食（如富含牛奶、啤酒）可能通过此不受调控的途径持续促进糖异生和脂肪生成，从而与脂肪肝、糖尿病前期等代谢性疾病相关联提供了潜在的分子机制。
五、 研究亮点
六、 其他有价值的内容
研究还提示，RNA作为一种含量丰富且不稳定的生物大分子，其分解产生的尿苷可能构成一种重要的能量储备形式，在饥饿或高能量消耗过程（如免疫反应）中被动员利用。此外，研究指出该通路的激活可能受益于某些糖酵解上段障碍的疾病（如Glut1缺乏综合征），为这些疾病的治疗提供了新的思路（即通过补充尿苷或诱导UPP1表达来绕过缺陷环节）。研究团队在同期另一项伴随研究中还发现，UPP1的表达受KRAS-MAPK信号通路调控，进一步将这一代谢通路与重要的致癌信号联系起来。