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研究报告：TCEP通过激活人类癌症通路基因诱导HepG2细胞肝毒性的机制研究
一、作者与发表信息
本研究由Abdullah M. Al-Salem（第一作者）、Quaiser Saquib（通讯作者）等团队合作完成，作者单位包括沙特阿拉伯King Saud University的动物学系和DNA研究实验室。研究发表于期刊Toxics（2020年11月，卷8，文章编号0109），标题为《Tris(2-chloroethyl) phosphate (TCEP) elicits hepatotoxicity by activating human cancer pathway genes in HepG2 cells》。
二、学术背景
研究领域：环境毒理学与分子毒理学，聚焦于有机磷阻燃剂（OPFRs）的肝毒性机制。
研究动机：
- TCEP（磷酸三(2-氯乙基)酯）是一种广泛用于塑料、泡沫和电子产品的阻燃剂，已在人体体液（如尿液、母乳）中检出，并被归类为“潜在致癌物”（类别2）。
- 既往研究表明TCEP与甲状腺癌、生殖和神经系统损伤相关，但其在肝细胞中的转录组学改变和致癌通路激活机制尚不明确。
研究目标：
1. 评估TCEP对肝细胞（HepG2）的细胞毒性、DNA损伤和凋亡的影响；
2. 揭示TCEP通过调控癌症通路基因诱导肝毒性的分子机制。
三、实验流程与研究方法
研究分为以下核心步骤：
1. 细胞培养与浓度筛选
- 研究对象：人肝癌细胞系HepG2（ATCC来源），选择因其与正常肝细胞的基因相似性。
- 浓度与时间：预实验确定非毒性暴露时间（1-2天无效应），最终选择100、200、400 μM TCEP处理3天。
2. 细胞毒性检测
- MTT法：检测线粒体脱氢酶活性，反映细胞存活率。400 μM TCEP使存活率降低70.92%。
- NRU法：评估溶酶体膜完整性，400 μM组存活率下降75.57%。
3. DNA损伤（彗星实验）
- 方法：碱性彗星实验量化DNA链断裂。
- 结果：400 μM TCEP处理组的橄榄尾矩（OTM）较对照组增加20倍，尾强度（TI）升高8.1倍，表明显著DNA损伤。
4. 流式细胞术分析
- 细胞周期与凋亡：400 μM组65.96%细胞处于SubG1凋亡峰。
- 氧化应激与钙离子内流：
- ROS：200 μM组DCF荧光强度增加189.2%；
- NO：400 μM组DAF-2荧光强度升高132.7%；
- Ca²⁺内流：Fluo-3荧光强度随浓度递增；
- 线粒体膜电位（ΔΨm）：Rh123荧光下降85.3%，提示线粒体功能障碍。
5. 转录组学分析（qPCR阵列）
- 基因筛选：84个人类癌症通路相关基因，阈值设定为表达变化>2倍（p<0.05）。
- 关键结果：
- 上调基因：如胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP5，77.71倍）、超氧化物歧化酶（SOD1，9.38倍）；
- 下调基因：如Snail同源蛋白（SNAI1，-24.25倍）、凋亡调节因子（CFLAR，-5.10倍）。
6. 数据分析
- 使用SigmaPlot 14.0进行ANOVA和Dunnett多重比较检验，显著性阈值p<0.05。
四、主要研究结果
- 细胞毒性：高浓度TCEP（400 μM）通过破坏线粒体和溶酶体功能导致细胞死亡。
- DNA损伤与凋亡：彗星实验和SubG1峰证实TCEP诱发DNA断裂和凋亡，与ROS/NO过量产生相关。
- 癌症通路激活：
- IGFBP5和SOD1上调提示氧化应激和生长信号紊乱；
- SNAI1下调可能削弱细胞间黏附，促进癌变。
- 线粒体功能障碍：ΔΨm崩溃和Ca²⁺内流加剧凋亡，与既往报道的TCEP神经毒性机制一致。
五、结论与价值
科学意义：
- 首次揭示TCEP通过调控IGFBP、MAPK等癌症通路基因诱导肝细胞毒性；
- 为OPFRs的致癌风险提供分子层面证据。
应用价值：
- 支持监管机构修订TCEP的安全阈值；
- 提示需关注长期低剂量暴露的潜在健康风险。
六、研究亮点
- 多维度毒性评估：整合细胞存活、DNA损伤、氧化应激和转录组学数据。
- 创新方法：
- 使用qPCR阵列精准筛选癌症通路基因；
- 结合流式细胞术与彗星实验验证毒性机制。
- 临床相关性：TCEP在人体内的生物累积性凸显研究紧迫性。
七、其他重要发现
- 非单调剂量效应：200 μM组ROS高于400 μM组，可能与高浓度下细胞凋亡加速导致氧化应激底物耗尽有关。
- 比较毒理学：TCEP与同类阻燃剂TCP的毒性机制差异（如SOD1上调为TCEP特异性反应）。
此研究为理解OPFRs的肝毒性机制提供了重要数据，并为后续风险评估和替代品开发奠定基础。