本研究由中国食品药品检定研究院（医疗器械标准管理中心，CFDA）的柯林楠、汤京龙、母瑞红团队与江阴贝瑞森生化技术有限公司的宋茂谦、高敏等合作完成，发表于《Chinese Journal of Medical Instrumentation》2018年第42卷第5期。研究聚焦贻贝粘蛋白（mussel adhesive protein, MAP）中3,4-二羟基苯丙氨酸（dopa）氧化还原状态的表征方法，旨在解决MAP作为生物粘合剂在临床应用中的质量控制难题。

学术背景
贻贝粘蛋白因其独特的粘附性、生物相容性和可降解性，在医疗领域（如骨骼修复、创伤闭合）具有广阔应用前景。MAP的功能核心在于其富含的dopa基团，该基团可通过共价/非共价键与多种材料结合。研究发现，dopa的氧化还原状态（还原态dopa与氧化态多巴醌）直接影响MAP的粘附性能：还原态dopa增强无机表面键合力，而氧化态多巴醌是材料固化和生物粘附的关键。然而，传统方法（如Arnow比色法）仅能检测dopa总量，无法区分其氧化还原状态。因此，开发一种能动态监测MAP氧化还原状态的方法，对产品研发和质量控制至关重要。

研究流程与方法
1. 样品制备
- 自然存放样品：选取2012-2016年间生产的MAP原液（江阴贝瑞森公司），用含0.005%乙酸的生理盐水稀释至0.5 mg/mL蛋白质浓度（n=5批次/年）。
- 加速氧化样品：取2016年样品调pH至7.0，37℃水浴中通入空气（流速6 L/min），每日取样5 mL（n=6天），模拟长期氧化过程。

1. 分析技术

   • 高效液相色谱法（HPLC）：采用Agilent Zobax SB 300A C8色谱柱，梯度洗脱（乙腈/0.1%三氟乙酸），检测波长280 nm。通过保留时间偏移监测dopa氧化状态变化。
     
   • 多巴含量测定：改良Arnow法（特异性检测邻苯二酚基团），酸性条件下与亚硝酸钠反应生成红色醌类化合物，500 nm波长比色。
     
   • 蛋白含量测定：考马斯亮蓝法（Bradford法），595 nm波长检测，确保氧化过程中蛋白总量稳定。
     

2. 实验设计

   • 自然存放样品用于观察长期氧化效应，加速氧化实验模拟短期剧烈氧化条件。两种模型通过HPLC保留时间变化与多巴含量下降的关联性，验证氧化还原状态的可表征性。
     

关键结果
1. 自然存放样品：
- HPLC显示主峰保留时间从2016年样品的30.24分钟逐渐前移至2012年样品的29.05分钟（图1）。
- 峰面积变化表明，30分钟峰（还原态dopa）随存放时间减少，29分钟峰（氧化态）增加，提示dopa自发氧化。

1. 加速氧化样品：

   • 多巴浓度从初始0.0238 mg/mL降至第6天的0.0195 mg/mL（表1），而蛋白浓度稳定（0.45-0.46 mg/mL），证实氧化仅影响dopa基团。
     
   • HPLC保留时间偏移趋势与自然存放样品一致（图3），主峰前移与多巴醌生成相关。
     

2. 方法关联性：

   • Arnow法检测的多巴含量下降与HPLC保留时间偏移显著相关（R²=0.91），证明HPLC可间接反映氧化还原状态。
     

结论与价值
本研究首次建立HPLC表征MAP氧化还原状态的方法，通过保留时间偏移量化dopa氧化程度。其科学价值在于揭示了MAP功能动态变化机制，而应用价值体现在：
1. 产品开发：为原位固化粘合剂的设计提供氧化态调控依据。
2. 质量控制：通过监测HPLC峰形变化，实现MAP稳定性评估。

研究亮点
1. 方法创新：将常规HPLC应用于dopa氧化还原态分析，无需复杂前处理。
2. 跨模型验证：自然存放与加速氧化实验相互印证，增强结论可靠性。
3. 临床指导意义：为MAP基医疗器械（如手术粘合剂）的保质期制定提供数据支持。

其他发现
研究还发现，dopa氧化速率受pH影响（pH 7.0时氧化加速），提示未来可探索pH调控策略以优化MAP性能。参考文献中引用的贻贝粘蛋白仿生应用（如仿生涂层[9]）进一步拓展了本研究的潜在应用场景。