这篇文档属于类型a，即报告了一项原创性研究。以下是对该研究的学术报告：
本研究的主要作者包括Elham Azizi、Ambrose J. Carr、George Plitas等，他们分别来自美国纽约的纪念斯隆-凯特琳癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center）、哥伦比亚大学（Columbia University）、霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute）等机构。该研究于2018年8月23日发表在《Cell》期刊上。
本研究的主要科学领域是肿瘤免疫学，特别是乳腺癌肿瘤微环境中的免疫细胞表型。肿瘤微环境中的免疫细胞表型对理解癌症进展和免疫治疗反应的机制至关重要。尽管已有研究表明免疫细胞在非淋巴组织和肿瘤中发挥重要作用，但关于肿瘤微环境中免疫细胞状态的连续性与离散性仍存在争议。本研究旨在通过单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq, scRNA-seq）技术，构建乳腺癌肿瘤微环境中免疫细胞的单细胞图谱，揭示免疫细胞表型的多样性和连续性。
研究流程包括以下几个主要步骤：
样本收集与处理
研究从8名未经治疗的乳腺癌患者中收集了45,000个免疫细胞，并匹配了正常乳腺组织、血液和淋巴结样本。所有样本均通过手术获取，并经过酶消化和流式细胞分选（FACS）纯化CD45+细胞。样本类型包括雌激素受体阳性（ER+）、孕激素受体阳性（PR+）、人表皮生长因子受体2扩增（HER2+）和三阴性乳腺癌（TNBC）。
单细胞RNA测序
使用indrop平台对纯化的CD45+细胞进行单细胞RNA测序。为了处理单细胞数据中的计算挑战，研究团队开发了一个预处理管道seqc和一个贝叶斯聚类和归一化方法biscuit。seqc用于提高单细胞数据的敏感性和选择性，而biscuit则用于同时进行归一化和聚类。
数据分析
数据分析包括多个步骤：首先，使用Phenograph聚类方法对每个患者的细胞进行聚类，并通过基因组相关性注释聚类。其次，通过整合所有肿瘤的数据，使用biscuit进行归一化和聚类，以消除批次效应并保留生物学变异。最后，构建了一个包含83个聚类的免疫细胞图谱，并通过交叉验证测试了聚类的稳健性。
T细胞受体（TCR）测序
为了进一步研究T细胞表型的多样性，研究还对27,000个T细胞进行了单细胞RNA测序和配对的TCR测序。这允许直接映射基因表达与TCR利用之间的关系。
免疫细胞表型的多样性
研究发现，肿瘤微环境中的免疫细胞表型显著扩展，特别是在T细胞和髓系细胞中。肿瘤中的免疫细胞表型空间比正常乳腺组织显著扩大，表明肿瘤微环境中的免疫细胞表型具有更高的异质性。
T细胞表型的连续性
通过扩散映射（diffusion maps）分析，研究发现T细胞表型呈现连续性的激活和分化状态，而不是传统的离散状态。这一发现挑战了传统的T细胞分化模型，表明T细胞在肿瘤微环境中可能经历连续的激活和分化过程。
TCR利用对表型多样性的影响
配对的单细胞RNA和TCR测序数据表明，TCR的多样性部分解释了T细胞表型的连续性。然而，每个TCR克隆型内的激活状态范围仍然广泛，表明TCR多样性并不是T细胞表型连续性的唯一驱动因素。
髓系细胞的异质性
研究发现，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）并不符合传统的M1/M2极化模型，而是表现出M1和M2基因特征的共表达。这一发现进一步支持了肿瘤微环境中巨噬细胞激活的复杂性。
本研究通过单细胞RNA测序技术，构建了乳腺癌肿瘤微环境中免疫细胞的单细胞图谱，揭示了免疫细胞表型的多样性和连续性。研究结果表明，肿瘤微环境中的免疫细胞表型具有显著的扩展性，T细胞表型呈现连续性的激活和分化状态，而TCR的多样性部分解释了这种连续性。此外，肿瘤相关巨噬细胞的表型复杂性挑战了传统的M1/M2极化模型。这些发现为理解肿瘤免疫微环境提供了新的视角，并为开发更有效的免疫治疗策略提供了理论基础。
重要发现
本研究首次通过单细胞RNA测序技术系统地揭示了乳腺癌肿瘤微环境中免疫细胞表型的多样性和连续性，特别是T细胞表型的连续激活和分化状态。
方法创新
研究团队开发了seqc和biscuit两个计算工具，用于处理单细胞RNA测序数据中的计算挑战，提高了数据的敏感性和选择性。
研究对象特殊性
研究涵盖了多种乳腺癌亚型，并匹配了正常乳腺组织、血液和淋巴结样本，为全面理解肿瘤微环境中的免疫细胞表型提供了丰富的数据支持。
本研究还提供了详细的实验方法和数据分析流程，为其他研究者进行类似研究提供了参考。此外，研究团队公开了seqc和biscuit的代码，促进了单细胞RNA测序数据分析的标准化和可重复性。
通过本研究，我们不仅加深了对乳腺癌肿瘤微环境中免疫细胞表型的理解，还为未来的免疫治疗研究提供了新的思路和工具。