单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）对抗汉坦病毒（hantavirus）糖蛋白复合物的研究：安第斯病毒（Andes virus, ANDV）糖蛋白G n和G c中和抗体在仓鼠模型中的保护作用

本文报道了一项由美国西奈山伊坎医学院（Icahn School of Medicine at Mount Sinai）微生物学系的Florian Krammer课题组主导，与美国国立卫生研究院（NIH）落基山实验室（Rocky Mountain Laboratories）及J. Craig Venter研究所等机构合作完成的原创研究。该研究于2020年3月24日发表在期刊mBio上（mBio 11:e00028-20）。主要作者包括James Duehr、Meagan McMahon、Brandi Williamson、Fatima Amanat、David W. Hawman、Gene S. Tan、Heinz Feldmann及Florian Krammer。研究聚焦于引起汉坦病毒心肺综合征（hantavirus cardiopulmonary syndrome, HCPS）的安第斯病毒（ANDV），旨在开发并表征针对其表面糖蛋白复合物（G n-G c）的中和性单克隆抗体，并评估其在动物模型中的保护效力。

汉坦病毒属（Orthohantavirus）成员每年在全球造成约20万例人类疾病，其中大多数为肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS），而少数为HCPS。HCPS主要流行于美洲，病死率高达30%至50%。2018年底至2019年初，阿根廷丘布特省埃普延（Epuyén）地区暴发了规模空前的ANDV疫情，至少29例实验室确诊，且强烈提示存在人传人传播。然而，针对汉坦病毒感染目前尚无获批的疫苗或特异性治疗药物。ANDV的M基因片段编码糖蛋白前体，经共翻译切割为G n和G c两个亚基，二者形成刺突复合物介导病毒侵入宿主细胞。由于G n在进化上变异较大而G c相对保守，推测G c可能被G n遮蔽而处于免疫亚显性地位。因此，本研究的目标是通过两种不同的疫苗接种策略诱导针对G n和G c的抗体，利用杂交瘤技术制备单克隆抗体，系统表征其结合特性、中和活性、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC）以及逃避突变表位，并最终在叙利亚仓鼠模型中验证保护效果。

研究流程分为四个主要阶段。第一阶段为免疫策略与杂交瘤融合。研究者采用两种不同的初免-加强方案免疫BALB/c小鼠。同源方案（AN组）用编码ANDV全长G n-G c的DNA疫苗初免两次，再用表达ANDV糖蛋白的重组水泡性口炎病毒（VSV-ANDV）加强；异源方案（HAP组）则依次用汉滩病毒（HTNV）、ANDV和普马拉病毒（PUUV）的G n-G c DNA疫苗进行异源初免，最后同样用VSV-ANDV加强。加强免疫后取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和免疫染色筛选，共获得17株特异性IgG单克隆抗体，其中8株来自同源方案，9株来自异源方案。第二阶段为抗体结合特性表征。通过ELISA检测抗体与纯化VSV-ANDV病毒颗粒及重组可溶性G n蛋白（rG n）的反应性，结果显示12/19株抗体与纯化病毒结合，其中5株与rG n结合。蛋白印迹（Western blot）分析表明，部分抗体的表位为线性或微构象型，而KL-AN-4H6在还原条件下丧失结合能力，提示其表位依赖二硫键维持的构象。第三阶段为功能学分析。采用病灶减少中和试验（focus reduction neutralization assay, FRNA）发现，所有结合纯化VSV-ANDV的12株抗体均具有中和活性，且对VSV-ANDV的半数抑制浓度（IC50）大多低于3 μg/ml。其中8株在ADCC报告试验中表现出活性，且均为非IgG1亚型，显示其Fc段能够有效激活Fc受体介导的效应功能。第四阶段为逃避突变分析与表位定位。通过将VSV-ANDV在递增浓度的各中和抗体下连续传代并挑取单克隆逃逸病毒，测序发现中和抗体靶向G n和G c上的多个不同表位。G n上的逃逸突变包括N121D、N108K、K124N、N121G和K225R，分别对应KL-AN-3F6、KL-AN-4E1、KL-AN-4G11、KL-AN-5E8和KL-HAP-4H6；G c上的逃逸突变包括A871Q、S831Y、P830S、N939H、S883R、N939D、C1129F、S883I等，对应KL-AN-1F12、KL-HAP-2D11、KL-HAP-2F7、KL-HAP-4E5、KL-HAP-5G4、KL-HAP-5H9和KL-HAP-6B12。研究者进一步利用基于图拉病毒（Tula virus, TULV）G n冷冻电镜结构（PDB 5FXU）和汉滩病毒（HTNV）G c融合前/后晶体结构（PDB 5LJY和5LK3）构建的同源模型，将逃逸突变定位到刺突复合物的空间结构上。计算拟合显示G n位于膜远端，其表位暴露于刺突顶部，而G c表位多位于其结构域表面，部分残基在三聚体融合后构象中被遮蔽。

随后，研究者选取了4株性质不同的中和抗体——KL-HAP-2D11（结合G c，ADCC阴性）、KL-AN-4E1（结合G n，ADCC阳性）、KL-AN-5E8（结合G n，ADCC阳性）和KL-HAP-6B12（结合G c，ADCC阳性）——在叙利亚仓鼠模型中评估单药保护效果。实验使用ANDV毒株Chi-9717869经鼻内接种200病灶形成单位（focus-forming units, FFU）感染仓鼠，在感染后第3天和第8天以25 mg/kg剂量腹腔注射抗体。结果显示，4株抗体治疗组的生存率均为100%（每组6只，观察至第42天），而IgG同型对照组全部死亡，死亡时间集中在第10至13天（P=0.0003，Mantel-Cox对数秩检验）。对照组动物临死前出现呼吸频率显著升高，而抗体治疗组未表现出明显呼吸窘迫。第10天肺组织病毒RNA定量显示，KL-AN-5E8和KL-HAP-6B12治疗组病毒基因组拷贝数显著低于对照组（P<0.0001，单因素方差分析），而KL-HAP-2D11和KL-AN-4E1组虽然仍有部分动物可检测到病毒RNA，但随时间推移逐渐清除；至第42天除1只KL-HAP-2D11组动物外，其余均检测不到病毒RNA。

综合上述结果，研究得出以下结论：通过同源或异源初免-加强策略可有效诱导针对ANDV G n-G c的不同表位的单克隆抗体，这些抗体的结合特性、中和活性、ADCC效应功能和表位定位具有高度多样性。中和抗体可分别靶向G n和G c，且G n的免疫优势地位在结构上得到了合理解释。在叙利亚仓鼠模型中，单药治疗即可实现100%保护，提示这些抗体具备开发为HCPS暴露后治疗的潜力。研究还表明，异源初免策略更倾向于诱导针对保守G c的抗体，这为未来广谱汉坦病毒疫苗设计提供了思路。

本研究的亮点在于：首次系统比较了同源与异源免疫策略对汉坦病毒糖蛋白抗体表位偏好的影响；利用计算结构模型将逃逸突变空间定位到G n-G c刺突复合物上，揭示了G n和G c中和表位的结构分布；在致死性ANDV仓鼠模型中证明了单克隆抗体单药治疗的完全保护效果，为后续多表位抗体鸡尾酒疗法奠定了实验基础。此外，研究建立的VSV-ANDV假病毒中和试验与活病毒中和试验的一致性验证，为今后在生物安全二级条件下进行高通量抗体筛选提供了可靠的替代平台。