寨卡病毒NS2B-NS3蛋白酶（NS2B-NS3pro）的溶液构象及其被食用植物天然产物抑制的研究

主要作者与机构： 本研究由Amrita Roy、Liangzhong Lim、Shagun Srivastava、Yimei Lu及Jianxing Song共同完成，其中Amrita Roy与Liangzhong Lim为并列第一作者，Jianxing Song为通讯作者。所有作者均隶属于新加坡国立大学生物科学系。该研究成果于2017年7月10日发表在期刊《PLOS ONE》上。

研究背景： 寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）是一种通过伊蚊传播的黄病毒（flavivirus）。近年来，寨卡病毒的大规模流行已与新生儿小头畸形和格林-巴利综合征等严重神经系统病变密切相关。然而，目前尚无有效的疫苗或药物可用于临床防治。寨卡病毒的基因组为单股正链RNA，翻译后产生一个约3500个残基的多聚蛋白。该多聚蛋白的正确剪切加工是病毒复制的必需步骤，此过程依赖于宿主的蛋白酶以及病毒自身编码的NS2B-NS3蛋白酶（NS2B-NS3pro）。因此，NS2B-NS3pro被公认为抗寨卡病毒药物研发的重要靶标。在所有黄病毒中，NS3蛋白酶的催化结构域需要与NS2B辅因子结合才能正确折叠并发挥活性。此前对登革病毒NS2B-NS3pro的研究表明，使用甘氨酸-丝氨酸连接子（linker）将NS2B与NS3pro共价连接虽然有利于结晶，但会引入额外的微秒至毫秒（μs-ms）尺度的构象动态，导致核磁共振（NMR）信号严重宽化。相比之下，非共价连接的复合物能够产生分辨率良好的NMR谱图。本研究旨在表征连接型与非连接型寨卡病毒NS2B-NS3pro复合物的溶液构象与催化参数，并从食用植物来源的天然产物中筛选具有抑制活性的小分子，以期为开发新型抗寨卡病毒药物提供基础。

研究流程与实验方法： 本研究的工作流程主要可分为四个阶段。第一阶段是克隆、表达与纯化。研究人员基于与登革2型病毒NS2B和NS3pro的序列比对，确定了亚洲型寨卡病毒株8375（GenBank ID: KU501217.1）中NS2B（残基48–100，跨膜区已删除）和NS3pro（残基14–185）的编码序列。他们构建了两种蛋白酶复合物：一种通过常用的(Gly)₄-Ser-(Gly)₄连接子将NS2B与NS3pro共价连接；另一种则分别表达和纯化NS2B与NS3pro，再在体外通过透析复性形成非共价复合物。连接型复合物主要以包涵体形式表达，通过Ni²⁺亲和层析在变性条件下纯化后，经透析复性获得可溶蛋白。非连接型复合物的NS3pro同样以包涵体形式表达，NS2B则以可溶形式表达；两者混合后在含有10 mM β-巯基乙醇的磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4）中透析复性。由于NS2B肽段分子量小于6 kDa，常规SDS-PAGE难以检测，因此采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）验证了非连接型复合物中NS2B的存在。第二阶段是生物物理表征。研究人员利用一维¹H NMR、二维¹H-¹⁵N异核单量子相干谱（HSQC）、远紫外圆二色光谱（CD）和固有紫外荧光光谱对连接型与非连接型复合物的折叠状态、二级结构含量和三级结构紧密程度进行了比较。为了解析NS2B在复合物中的构象，他们制备了选择性¹⁵N标记的NS2B或NS3pro样品，并采集了单独的NS2B以及NS2B与NS3pro复合态的HSQC谱。此外，通过添加牛胰蛋白酶抑制剂（BPTI）将复合物从开放构象转变为闭合构象，以观察NS2B构象的动态变化。第三阶段是酶学催化性质表征。研究使用了三种荧光底物（Bz-NKRR-AMC、Boc-GRR-AMC和Boc-GKR-AMC）来检测蛋白酶的底物特异性。测定了连接型与非连接型复合物在不同pH值（4–10.5）、不同NaCl浓度（0–250 mM）以及不同甘油浓度（0–40%）下的催化活性。在含有20%甘油和1%二甲基亚砜（DMSO）的50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）中，测定了稳态动力学参数Km、kcat和kcat/Km。第四阶段是天然产物抑制剂的筛选与表征。研究人员从食用植物中常见的天然产物中筛选了多种黄酮类化合物（flavonoids）和天然酚类化合物。通过测定半数抑制浓度（IC₅₀）和抑制常数（Ki），结合Lineweaver-Burk双倒数作图法判断抑制模式。最后，利用AutoDock软件（版本4.2）将六个活性化合物对接至寨卡病毒NS2B-NS3pro的晶体结构（PDB ID: 5LC0）上，以阐明其结合口袋和构效关系。

主要结果： 在生物物理表征方面，一维¹H NMR显示连接型与非连接型复合物均折叠良好，但连接型复合物的谱峰更宽，表明其存在额外的μs-ms构象动态。非连接型复合物的¹H-¹⁵N HSQC谱图分散良好，而连接型复合物仅能检测到极少数峰。选择性标记实验表明，¹⁵N标记的NS3pro在与未标记NS2B复合时表现出良好的HSQC分散性；而¹⁵N标记的NS2B在与未标记NS3pro复合时，HSQC谱峰分散极窄，仅检测到约29个峰，且这些可检测的峰归属于C端残基Arg73-Lys100。这说明NS2B的N端残基（Ser48-Ser71）因μs-ms尺度的动态导致谱峰宽化不可见，而C端残基则高度无序，缺乏紧密的三级结构。添加BPTI后，Arg73-Ser85的HSQC峰消失，仅剩Leu86-Lys100的弱峰，表明在闭合构象中，NS2B的C端进一步与NS3pro结合，仅最末端的15个残基保持无序。远紫外CD光谱显示，寨卡NS2B-NS3pro复合物的最大负信号约在201 nm，且在200 nm以下无正信号，与登革2型复合物（最大负信号在217 nm，192 nm处有较大正信号）明显不同，表明寨卡复合物含有更多的无序区域。固有紫外荧光光谱显示五个色氨酸（Trp）残基的发射最大值在344–348 nm之间，与登革复合物相似，说明这些Trp残基处于相对疏水的埋藏环境中。在酶学性质方面，寨卡蛋白酶对Bz-NKRR-AMC的切割效率远高于其他两种底物，提示其对P3位碱性残基有更高的需求。最适pH约为9.5。NaCl浓度升高显著降低催化活性，在150 mM NaCl存在下，连接型与非连接型酶的活性分别降至原来的13.6%和8.2%。甘油在20%–30%浓度时能提高活性。在50 mM Tris-HCl（pH 8.5）缓冲液中，连接型复合物的Km为43.4 μM，kcat为48.9 s⁻¹；非连接型复合物的Km为60.2 μM，kcat为93.1 s⁻¹。在筛选天然产物时，研究人员鉴定出六种具有显著抑制活性的化合物：五种黄酮类化合物（杨梅素myricetin、槲皮素quercetin、木犀草素luteolin、异鼠李素isorhamnetin、芹菜素apigenin）和一种天然酚类化合物（姜黄素curcumin）。其中杨梅素的抑制活性最强（IC₅₀ = 1.26 μM，Ki = 0.77 μM），芹菜素最弱（IC₅₀ = 56.32 μM，Ki = 34.02 μM）。而大豆苷元（daidzein，一种异黄酮）、儿茶素（catechin）和白藜芦醇（resveratrol）在高达500 μM时均未检测到抑制活性。Lineweaver-Burk作图显示，六种活性化合物均不改变Km值，仅降低Vmax，表明它们均为非竞争性抑制剂，即通过变构机制发挥作用。分子对接结果显示，这六种化合物均结合在活性位点背面的一个口袋中。该口袋由NS2B的β-折叠（Leu74-Leu78和Asp83-Leu86）和NS3pro的表面共同构成，且该区域与活性位点抑制剂CN-716结合位点相邻。五种黄酮类化合物在口袋中的结合方式高度重叠，其苯环与NS2B形成的壁面接触，苯并吡喃环则位于NS3pro提供的腔中。姜黄素的一个苯环与黄酮类结合位点相同，另一个苯环则延伸至一个新的额外口袋，与NS3pro的Asp122和Ile165形成氢键。氢键网络分析表明，杨梅素与NS3pro的Lys73、Asn152、Gln74和Gly124形成六个氢键；槲皮素因缺少5’-羟基而少一个与Asn152的氢键；异鼠李素因3’-羟基被甲基化而失去与Lys73的氢键；木犀草素因缺少3-羟基而失去与Gln74的氢键；芹菜素进一步缺少3’-羟基而再失去一个氢键。这些氢键的丢失与抑制活性的降低趋势高度吻合。

结论与意义： 本研究系统地表征了寨卡病毒NS2B-NS3pro复合物在溶液中的构象与动力学特性，揭示了其NS2B的C端在开放构象中高度无序，而在闭合构象中部分有序化的独特性质。这一发现与登革病毒NS2B-NS3pro形成鲜明对比，并提示寨卡蛋白酶可能对变构调控更为敏感。更重要的是，本研究从食用植物来源的天然产物中发现了六种非竞争性抑制剂，其中杨梅素的Ki值低至0.77 μM。这些化合物与现有的活性位点抑制剂在抑制模式和化学骨架方面均存在根本差异，为开发新型变构抑制剂提供了全新的起点。此外，由于这些天然产物广泛存在于刺山柑、茶叶、红洋葱、芹菜、西兰花、青椒和姜黄等日常食物中，且已被证明对人体健康具有多种益处，本研究的发现可能为公众提供一种即时可行的膳食干预策略以辅助对抗寨卡病毒感染。

研究亮点： 本研究的亮点主要体现在以下几个方面。第一，首次系统比较了连接型与非连接型寨卡病毒NS2B-NS3pro复合物的溶液构象与动力学差异，明确了连接子对NMR谱线宽化的影响。第二，通过选择性同位素标记策略，在原子分辨水平上揭示了寨卡病毒NS2B的C端残基在开放与闭合构象中的无序-有序转变；这一发现与随后发表的晶体学结果高度一致。第三，发现了六种来自食用植物的天然产物对寨卡病毒NS2B-NS3pro具有非竞争性抑制作用，并通过分子对接阐明了其结合口袋和氢键网络。第四，通过对黄酮类化合物的结构-活性关系分析，明确了苯并吡喃环的存在、苯环上羟基的数量和位置等结构特征对抑制活性的关键影响。第五，姜黄素的双位点结合模式为设计基于多价结合的高亲和力抑制剂提供了新思路。这些成果不仅加深了对黄病毒蛋白酶构象可塑性的理解，也为基于天然产物骨架的抗寨卡病毒药物开发奠定了重要基础。