免疫调节药物（IMiDs）通过CRL4CRBN E3泛素连接酶调控转录因子降解的结构机制研究
作者及发表信息
本研究由Eric S. Fischer（Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Switzerland）领衔，联合Kerstin Böhm、John R. Lydeard等来自瑞士巴塞尔大学、哈佛医学院、诺华生物医学研究所等机构的团队合作完成，于2014年8月发表在Nature期刊（DOI:10.1038/nature13527）。
研究背景
沙利度胺（Thalidomide）及其衍生物来那度胺（Lenalidomide）、泊马度胺（Pomalidomide）统称为免疫调节药物（Immunomodulatory Drugs, IMiDs），虽因致畸性闻名，但在多发性骨髓瘤和5q缺失型骨髓增生异常综合征中显示出显著疗效。此前研究发现，IMiDs通过靶向E3泛素连接酶复合体CRL4CRBN（由CUL4-RBX1-DDB1-CRBN组成），促使转录因子Ikaros/Aiolos（IKZF1/3）被泛素化降解。然而，IMiDs与CRL4CRBN复合体的分子结合模式及其对底物选择的调控机制尚不明确。
研究流程与方法
1. DDB1-CRBN-IMiDs复合体晶体结构解析
- 研究对象：人源DDB1与鸡源CRBN（ggCRBN）嵌合体（因序列高度保守），结合沙利度胺、来那度胺或泊马度胺。
- 方法：
- 蛋白纯化与结晶：表达并纯化DDB1-ggCRBN复合体，通过共结晶获得复合物晶体（分辨率分别为3.0 Å、3.0 Å和3.5 Å）。
- 结构分析：X射线衍射数据经处理后，通过分子置换法解析结构。
- 关键发现：
- CRBN的C端结构域（CTD）含有一个高度保守的锌离子结合位点（由Cys325/328/393/396配位）和IMiDs结合口袋。
- IMiDs的谷氨酰亚胺基团通过氢键（His380/Trp382）和疏水作用（Trp388/Trp402/Phe404）锚定在CRBN上，而苯二甲酰基团暴露于溶剂中（图2）。
- （S）-沙利度胺与CRBN的结合亲和力高于（R）-对映体（Kd≈250 nM），与体内实验结果一致。
2. CRBN作为CRL4CRBN的底物受体机制
- 功能验证：
- 体外泛素化实验：重组CRL4CRBN复合体在ATP、E1/E2酶和泛素存在下，证明CRBN自身发生泛素化（K39/K43位点），且IMiDs不影响此过程。
- 底物筛选：通过人类蛋白芯片（约9,000种蛋白）结合CRL4CRBN的泛素化分析，发现转录因子MEIS2为内源性底物（图4a）。
- 细胞实验：
- MEIS2稳定性检测：在SK-N-DZ和M059J细胞中，来那度胺处理可稳定MEIS2蛋白水平（1.5-2.5倍），而CRBN敲除导致MEIS2积累（图4b-d）。
- Ikaros降解特异性：IMiDs的苯二甲酰基C4位小修饰（如-NH₂）促进Ikaros降解，而大基团则抑制（图3c），表明溶剂暴露区域决定底物选择性。
3. IMiDs的双重调控模型
- 机制阐明：
- IMiDs占据CRBN的底物结合口袋，竞争性抑制内源性底物（如MEIS2）的结合（图5a-c）。
- 同时，IMiDs通过暴露的C4氨基等基团招募Ikaros/Aiolos至CRL4CRBN复合体，触发其泛素化降解（图5d）。
主要结果与结论
- 结构基础：首次解析了DDB1-CRBN-IMiDs复合体结构，揭示CRBN通过PUA折叠结构域结合IMiDs，且其Zn²⁺结合位点与药物结合无关。
- 功能机制：
- IMiDs通过”占据-募集”双模式调控CRL4CRBN的活性：抑制MEIS2泛素化，同时促进Ikaros降解。
- MEIS2的鉴定为IMiDs致畸性提供了潜在解释（MEIS2参与肢体发育）。
- 临床意义：
- 为设计选择性IMiDs衍生物（如减少致畸性、增强抗癌活性）提供了结构模板。
- 证明小分子可双向调控E3连接酶活性，开辟了靶向蛋白质降解（TPD）药物开发新思路。
研究亮点
- 方法创新：
- 采用跨物种嵌合体策略解决人源CRBN结晶难题。
- 结合蛋白芯片筛选与正交细胞验证，系统性鉴定MEIS2为内源性底物。
- 理论突破：
- 提出”配体诱导底物选择性”模型，解释IMiDs的拮抗-激动双功能。
- 发现CRBN的PUA结构域进化自古老的甲硫氨酸亚砜还原酶，但丧失催化活性后转向底物识别。
其他价值
本研究还分析了CRBN突变（如精神发育迟滞相关突变E106*和R419X）的结构效应，为相关疾病机制研究提供线索（扩展数据图6）。
（注：原文中所有实验细节均参考扩展数据图及表格，如热迁移实验、ITC亲和力测定等未在报告中逐一展开。）