关于一种基于适配体-金纳米颗粒缀合物的“开启”式无标记比色生物传感器用于检测淀粉样蛋白-β寡聚体的研究报告

本报告旨在向研究人员介绍由Ying Tu、Junjie Wu、Keke Chai、Xiaochun Hu、Yuan Hu、Shuo Shi和Tianming Yao*（通讯作者）共同完成的一项原创性研究。该团队来自同济大学化学科学与工程学院（中国上海）。这项研究成果以题为《A turn-on unlabeled colorimetric biosensor based on aptamer-AuNPs conjugates for amyloid-β oligomer detection》的论文形式，发表于学术期刊《Talanta》第260卷（2023年），文章编号124649，并于2023年5月5日在线发表。

一、 研究背景与目的

本研究属于分析化学与生物传感技术领域，具体聚焦于阿尔茨海默病（Alzheimer‘s disease， AD）早期诊断生物标志物的检测。阿尔茨海默病是一种普遍的神经退行性疾病，目前尚无治愈方法，因此早期诊断至关重要。淀粉样蛋白-β寡聚体（Amyloid-β oligomers， AβO）被认为是AD早期诊断的核心生物标志物，其在患者脑脊液（cerebrospinal fluid， CSF）中的浓度极低（亚皮摩尔水平），但具有显著的神经毒性。因此，开发高灵敏度、高特异性的AβO检测方法具有重要的临床意义。

目前已有多种方法用于检测AβO，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、表面等离子体共振（SPR）、表面增强拉曼光谱（SERS）和电化学生物传感器等。然而，这些方法通常需要昂贵的仪器、繁琐的操作步骤和专业的技术人员，且部分基于抗体的免疫传感器可能存在交叉反应性和高非特异性结合的问题。因此，研究领域内持续需要建立简单、便捷、选择性好的AβO检测新方法。

比色分析法因其简单、灵敏、快速且可通过裸眼直接观察而受到特别关注。金纳米颗粒（AuNPs）由于其高消光系数和距离依赖的光学性质，在构建比色传感器中扮演重要角色。核酸适配体（aptamer）作为新兴的识别元件，具有高结合亲和力与特异性、合成方便、成本效益高以及在环境温度下稳定性好等优点，被广泛用于生物传感器。

本研究旨在开发一种新型的、无标记的比色型适配体传感器（aptasensor），用于高灵敏度、高特异性检测淀粉样蛋白-β1-40寡聚体（Aβ40-o）。其核心创新在于构建了一种新型的“适配体-多聚胸腺嘧啶-多聚腺嘌呤-金纳米颗粒”（PA-PT-Apt@AuNPs）复合物平台，并利用盐诱导聚集的原理，实现目标物存在下纳米颗粒稳定性的“开启”式信号响应。

二、 研究详细流程

本研究包含多个紧密衔接的实验步骤，主要流程如下：

1. 研究对象的制备与表征： * Aβ40寡聚体（Aβ40-o）与纤维（Aβ40-f）的制备： 研究首先合成了目标检测物Aβ40-o和作为对照的Aβ40-f。具体流程包括：将冻干的Aβ40肽溶于六氟异丙醇（HFIP）以解离预存寡聚体，冻干后得到粉末。将粉末溶于二甲基亚砜（DMSO）并快速用磷酸盐缓冲液（PB）稀释至100 μM，随后在4°C下孵育24小时以形成寡聚体。若要制备纤维，则将单体溶液在37°C下振荡孵育72小时。所有肽浓度均按Aβ40单体当量浓度计算。 * 表征： 使用透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）对制备的Aβ40-o和Aβ40-f进行形貌和尺寸表征。TEM负染图像显示Aβ40-o为球形颗粒，直径在6-20 nm之间。AFM图像进一步证实了球形寡聚体的均匀分布，平均高度为2.3-5.2 nm。Aβ40-f则呈现出典型的纤维状结构。

2. 金纳米颗粒（AuNPs）及传感器复合物（PA-PT-Apt@AuNPs）的制备与表征： * AuNPs的合成： 采用经典的柠檬酸钠还原氯金酸（HAuCl₄）的方法，制备了直径约13 nm的AuNPs，并通过紫外-可见光谱（UV-Vis）确认其在519 nm处有特征吸收峰。 * PA-PT-Apt@AuNPs复合物的构建： 这是本研究的核心创新步骤。研究人员设计并合成了由三部分组成的DNA序列：一段用于特异性识别Aβ40-o的适配体序列；一段多聚胸腺嘧啶（polyT）作为间隔臂（spacer）；以及一段多聚腺嘌呤（polyA）作为锚定块。利用polyA序列对AuNPs表面的优先粘附特性，将整个PA-PT-Apt寡核苷酸锚定到AuNPs表面，形成PA-PT-Apt@AuNPs复合物。此方法避免了传统硫醇化DNA修饰的额外成本、易氧化及取向难以控制等问题。polyA锚定有助于减少非特异性吸附，并使适配体保持直立构象，利于与目标物结合；polyT间隔臂则为适配体识别目标蛋白提供了更大的空间灵活性。 * 表征： 通过动态光散射（DLS）和Zeta电位分析对复合物进行表征。与裸AuNPs（流体动力学直径Dh=17.74 nm， Zeta电位=-24.0 mV）相比，修饰后的复合物（如A20T5Apt@AuNPs）尺寸显著增加（Dh=61.20 nm），表面负电性增强（Zeta电位=-35.9 mV），证实了DNA成功修饰到AuNPs表面并形成了伸展构象。盐耐受性实验表明，所制备的复合物在高达300 mM NaCl浓度下能保持稳定至少20分钟，远优于裸AuNPs（在40 mM NaCl下即快速聚集），这为其在生理盐浓度环境（如脑脊液，~150 mM NaCl）中应用奠定了基础。

3. 传感器工作原理验证与条件优化： * 原理验证： 通过UV-Vis光谱和TEM成像验证了传感器的工作原理。在150 mM NaCl条件下，PA-PT-Apt@AuNPs分散良好，溶液呈红色，UV-Vis谱在~525 nm处有单一吸收峰。加入MgCl₂后，由于盐屏蔽效应导致纳米颗粒间静电斥力和空间位阻减小，引发聚集，溶液变蓝，并在~630 nm处出现新的吸收峰。然而，当体系中存在Aβ40-o时，适配体与目标物特异性结合形成复合物，包裹在AuNPs周围，增强了纳米颗粒在盐条件下的稳定性，从而抵抗了MgCl₂诱导的聚集，溶液颜色保持红色，630 nm处的吸收峰不明显。这构成了“目标存在-颜色保持红（信号开启）”的检测逻辑。 * 条件优化： * 盐浓度优化： 系统测试了不同MgCl₂浓度对PA-PT-Apt@AuNPs聚集程度的影响，以确定在后续定量检测中既能有效诱导空白样品聚集，又不会导致目标物-复合物过度聚集的MgCl₂浓度。通过监测吸光度比值A630/A530（比值越高，聚集程度越大）来评估。 * 孵育时间优化： 考察了Aβ40-o与A20T5Apt@AuNPs结合孵育时间（0-120分钟）对信号响应（A630/A530）的影响。结果表明，孵育1.5小时后信号趋于稳定，因此选择1.5小时作为最佳孵育时间。 * DNA序列结构优化： 为了获得最佳检测灵敏度，研究人员系统性地优化了polyA锚定块和polyT间隔臂的长度，构建了四种不同的复合物：A10T5Apt@AuNPs， A20T5Apt@AuNPs， A30T5Apt@AuNPs和A10T10Apt@AuNPs。通过比较它们对Aβ40-o的检测性能（线性范围、检测限等），探究空间构型对传感器灵敏度的影响。

4. 定量检测、选择性及实际样本回收率评估： * 定量检测与性能比较： 使用优化后的条件，将不同浓度的Aβ40-o与各型PA-PT-Apt@AuNPs复合物孵育，再加入最佳浓度的MgCl₂，测量UV-Vis光谱，以A630/A530比值对Aβ40-o浓度作图，建立校准曲线。研究发现，polyA长度（从A10到A30）对传感器性能影响较小，但polyT间隔臂的长度显著影响灵敏度。A10T10Apt@AuNPs表现出最佳性能，在10.0 nM至100.0 nM范围内呈良好线性，回归方程为A630/A530 = 1.3787 – 9.2282 × C (R² = 0.9964)，检测限（LOD）低至3.03 nM，定量限（LOQ）为9.99 nM。与A10T5Apt@AuNPs相比，灵敏度提高了约2.4倍，这归因于更长的T10间隔臂为适配体的折叠和与Aβ40-o的结合提供了更充裕的空间。 * 选择性实验： 为了评估传感器的特异性，测试了多种潜在干扰物质，包括：Aβ40纤维（Aβ40-f）、Aβ42寡聚体（Aβ42-o）、Aβ42纤维（Aβ42-f）、tau蛋白R3结构域聚集体（R3g，模拟tau聚集体）、牛血清白蛋白（BSA）和葡萄糖氧化酶（GOD）。结果表明，只有Aβ40-o能引起A630/A530比值的显著下降（即明显的抗聚集效应），而其他物质引起的信号变化很小，证明了该适配体传感器对Aβ40-o具有高度的特异性识别能力。 * 实际样本回收率实验： 为了评估传感器在实际复杂基质中的应用潜力，在2倍稀释的人工脑脊液（aCSF）样本中进行了加标回收实验。在20.0 nM至100.0 nM的加标浓度范围内，回收率在96.7%至110%之间，相对标准偏差（RSD）在2.0%至4.8%之间，显示了良好的准确度和精密度。 * 储存稳定性测试： 将制备的A10T10Apt@AuNPs传感器在4°C的PBS中储存30天，其性能RSD为4.9%，表明具有良好的储存稳定性，这得益于DNA适配体和AuNPs在环境条件下的固有稳定性。

三、 主要研究结果

1. 成功构建了新型PA-PT-Apt@AuNPs比色适配体传感器平台。 利用polyA的优先锚定特性，实现了适配体在AuNPs表面的可控、直立固定，避免了目标物与AuNPs表面的直接相互作用，提高了特异性。polyT间隔臂的引入优化了适配体的空间可及性。
2. 验证了基于盐诱导聚集/抗聚集的“开启”式检测原理。 实验数据（UV-Vis光谱和TEM图像）清晰表明，无Aβ40-o时，MgCl₂引起复合物聚集（红变蓝，630 nm处出现吸收）；有Aβ40-o时，适配体-目标复合物的形成稳定了纳米颗粒，抵抗了盐诱导的聚集（保持红色，630 nm处无显著吸收）。
3. 通过系统优化获得了高灵敏度检测性能。 优化MgCl₂浓度和孵育时间后，进一步通过调节polyT间隔臂长度，将检测灵敏度最大化。A10T10Apt@AuNPs传感器对Aβ40-o的检测限达到3.03 nM，线性范围为10.0-100.0 nM。这证明了通过调控DNA序列结构来优化传感器性能的有效性。
4. 证明了传感器的高特异性与良好的实际应用潜力。 选择性实验表明，传感器对Aβ40-o的响应远高于其他Aβ形态、tau聚集体或常见球状蛋白。在模拟生理环境（aCSF）中的加标回收实验获得了满意的回收率和精密度，表明该方法有望用于实际生物样本中Aβ40-o的检测。
5. 证实了传感器具有良好的稳定性。 复合物在高盐（150 mM NaCl）环境下稳定，且制备的传感器在4°C下储存30天性能变化很小，满足了实际应用中对稳定性的基本要求。

这些结果层层递进：首先，成功构建并表征了传感器核心材料；其次，通过原理验证实验确立了检测机制的可行性；接着，通过条件优化将检测性能提升至最佳；最后，通过选择性和回收率实验证明了传感器的可靠性与实用性。所有结果共同支撑了研究的最终结论。

四、 研究结论与价值

本研究成功开发了一种基于PA-PT-Apt@AuNPs复合物的无标记、比色型适配体传感器，用于高灵敏度、高特异性检测阿尔茨海默病相关生物标志物Aβ40寡聚体。

科学价值与应用价值： * 方法学创新： 提出了一种利用polyA锚定和polyT间隔臂来精确调控AuNPs表面适配体空间取向和构象的策略。这种方法比传统的硫醇化修饰更经济、更稳定，且能更好地控制适配体的识别活性。 * 高性能传感平台： 所构建的传感器结合了比色法的直观性、适配体的高特异性以及AuNPs的信号放大效应，实现了对Aβ40-o的“开启”式、免标记检测，检测限低至纳摩尔级别，且能在接近生理盐浓度的条件下工作。 * 早期诊断潜力： 为阿尔茨海默病的早期诊断提供了一种快速（响应时间约1.5小时）、成本低、操作简便且灵敏度高的潜在检测工具。该方法无需复杂仪器和抗体/酶系统，更适合现场或基层医疗机构的筛查应用。 * 平台通用性： 该传感设计策略具有普适性。通过替换特异性适配体序列，此平台可扩展用于检测其他多种蛋白质靶标，为开发针对不同疾病标志物的新型生物传感器提供了通用模板。

五、 研究亮点

1. 巧妙的分子设计： 创新性地采用“适配体-polyT-polyA”三段式DNA结构来功能化AuNPs。polyA实现高效、定向锚定，polyT提供柔性间隔以优化适配体构象，这种设计显著提升了生物识别效率与检测灵敏度。
2. 简单而高效的检测机制： 基于目标物结合前后纳米颗粒抗盐聚集能力变化的比色信号输出机制，原理直观，操作简单，避免了复杂的标记或信号放大步骤。
3. 通过序列工程化优化性能： 首次系统研究了polyA锚定块和polyT间隔臂长度对Aβ40-o检测灵敏度的影响，发现polyT间隔臂长度是提高灵敏度的关键可调因素，为未来设计高性能适体传感器提供了重要指导。
4. 优异的实际应用特性： 传感器在生理盐浓度下稳定，对目标物特异性强，在模拟脑脊液样本中表现良好，并具有较长的储存稳定性，显示出向实际临床检测转化的潜力。

六、 其他有价值的内容

研究还提及了与以往基于适配体直接吸附在AuNPs表面的传感器相比的优势。传统的非共价吸附方式中，目标物（如富含-NH₂基团的AβO）可能与AuNPs表面未反应的Au位点直接相互作用（形成Au-N键），干扰特异性识别。而本研究采用的polyA锚定策略能够覆盖AuNPs表面，有效避免了这种非特异性吸附，从而提高了检测的特异性。这一点对于像AβO这样具有强吸附性的蛋白质目标物的检测尤为重要。