本文是AAPS PharmSciTech期刊于2007年8月3日发表的一篇原始研究论文，题为“Development of a bladder instillation of the indoloquinone anticancer agent EO-9 using tert-butyl alcohol as lyophilization vehicle”。研究由荷兰Slotervaart医院/荷兰癌症研究所药学和药理学系的Sabien C. van der Schoot、Bastiaan Nuijen、Jos H. Beijnen，以及荷兰乌特勒支大学药学系的Frits M. Flesch和美国Spectrum Pharmaceuticals, Inc.的Ashok Gore、Dorla Mirejovsky、Luigi Lenaz共同完成。通讯作者为Bastiaan Nuijen。

该研究属于药剂学与药物制剂开发领域，主要围绕吲哚醌类抗肿瘤药物EO-9（3-羟甲基-5-氮丙啶基-1-甲基-2-(1H-吲哚-4,7-二酮)-丙-β-烯-α-醇）的膀胱灌注制剂开发。EO-9是丝裂霉素C（mitomycin C, MMC）的合成类似物，作为一种生物还原性烷化剂，其在缺氧肿瘤区域具有优先细胞毒性，且骨髓毒性较低，因此被视为治疗浅表性膀胱癌的潜在药物。然而，EO-9的制剂开发一直受到其在水性环境中溶解度低、化学稳定性差的制约：在中性或酸性条件下，EO-9的氮丙啶（aziridine）部分易发生质子化并被水分子亲核进攻，生成无活性的降解产物EO-5a。早期为静脉给药开发的冻干制剂虽通过研磨原料药、加入乳糖并以氢氧化钠调节pH至9~9.5来提高稳定性，但静脉给药后未观察到肿瘤反应，原因可能在于EO-9在生理pH 7.4环境下迅速失活，尚未到达肿瘤即转化为EO-5a。因此，本研究将给药途径改为膀胱内灌注，使药物更直接地作用于浅表性膀胱癌病灶，并围绕此目的开发一种稳定的EO-9膀胱灌注用冻干制剂。

研究的工作流程可分为几个主要环节：处方前溶解度与稳定性研究、冷冻干燥工艺优化、制剂生产与稳定性考察、复溶溶液开发以及制剂晶型与形态学表征。首先，研究者系统考察了叔丁醇（tert-butyl alcohol, TBA）对EO-9溶解度和稳定性的影响，配制含0%、10%、20%、30%、40%和50%（体积比）TBA的注射用水（water for injection, WFI）溶液，并加入1%（质量/体积）碳酸氢钠（NaHCO₃）作为碱化剂。结果显示，EO-9在纯WFI中的最大溶解度仅为0.5 mg/mL，而在30%、40%和50% TBA/WFI溶液中的最大溶解度分别提高至4.4、6.0和8.1 mg/mL，且TBA体积分数达到20%以上时对EO-9具有进一步稳定作用。基于Ⅰ期临床试验剂量范围（0.5~32 mg EO-⁹⁄₄₀ mL膀胱灌注液）的考虑，选择每瓶8 mg EO-9的目标含量，并以40% TBA为溶剂配制4 mg/mL的EO-9溶液，从而将灌装体积较原静脉制剂减少20倍。随后，研究者比较了三种碱化剂（氢氧化钠、葡甲胺、碳酸氢钠）和两种赋形剂（甘露醇和聚乙烯吡咯烷酮）制备的冻干制剂在不同储存条件下的稳定性。结果表明，含葡甲胺的制剂在40°C/75%相对湿度条件下储存1周即出现明显降解，而含碳酸氢钠的制剂稳定性最好。进一步实验确定，每瓶含8 mg EO-9、50 mg甘露醇和20 mg碳酸氢钠的处方稳定性最佳，因此被选为后续开发处方。

在冷冻干燥工艺优化方面，研究者首先利用差示扫描量热法（differential scanning calorimetry, DSC）对含EO-9 4 mg/mL、甘露醇25 mg/mL和碳酸氢钠10 mg/mL的40% TBA溶液进行热分析。DSC热谱图显示，该溶液在加热过程中出现三个吸热信号，起始温度分别约为-14°C、-8°C和-3°C。其中-14°C和-8°C的吸热峰分别对应TBA水合物-冰共晶物和TBA水合物的熔融；-3°C的吸热峰则可能来自含90%~95% TBA的TBA/TBA水合物晶体。研究还发现，在同时存在甘露醇和碳酸氢钠时，TBA水合物的结晶受到抑制，其热谱图显示出较不尖锐的起始吸热峰。此外，单独的甘露醇在碳酸氢钠存在下结晶也受到抑制。因此，为获得完全结晶的TBA并形成多孔、均一的冻干饼块，研究者在冷冻过程中引入-20°C的退火（annealing）步骤，并将一次干燥阶段的产品温度控制在-20°C以下。通过对含不同TBA比例（0%~40%体积比）的TBA/WFI溶液进行冷冻干燥动力学研究，发现TBA体积分数高于20%时可显著提高升华速率，缩短一次干燥时间。对40% TBA/WFI溶液的研究表明，经过6小时一次干燥几乎全部TBA和WFI均已升华。考虑到加入药物和辅料后升华速率可能略有下降，最终将一次干燥时间设定为7小时，搁板温度为-10°C，腔室压力为0.20 mbar。二次干燥的优化结果显示，腔室压力从0.20 mbar降至0.05 mbar对残余水分含量影响不大，但提高搁板温度可降低水分含量：在25°C下干燥24小时残余水分约为7.00%，而在35°C和45°C下分别为4.59%和3.64%。残余TBA含量约为0.6%（质量分数），即每瓶含8 mg EO-9的冻干品中约有0.47 mg TBA。根据ICH Q3C指南，TBA属3类有机溶剂，每日允许暴露量为50 mg，而Ⅰ期临床试验中单次给药对应的TBA暴露量仅为0.03~1.87 mg，远低于安全限值，因此无需进一步降低。最终，优化后的冻干周期总时长由原来的66小时缩短为35小时。

在制剂表征方面，扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）观察显示，原料药EO-9为不规则的小晶体，但在冻干产品中未观察到这些晶体，提示EO-9在冻干后转变为无定形或晶型发生改变。优化前的冻干产品中可见明显的碳酸氢钠晶体，而优化后产品则更加均一，这与TBA更完全的结晶抑制了碳酸氢钠晶体析出有关。X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）分析表明，甘露醇、碳酸氢钠和EO-9本身均为结晶性物质，但未退火的冻干产品呈完全无定形状态；加入退火步骤后，冻干产品中出现少量微小结晶信号，其中一个位于约9.5°的衍射峰被归属为甘露醇的δ多晶型。尽管退火引入少量结晶，但产品复溶时间并未延长，使用10 mL复溶溶液可在5分钟内完全复溶。

在复溶溶液开发方面，由于EO-9在水性介质（如0.9%氯化钠溶液或5%葡萄糖溶液）中溶解度和稳定性较差，研究者选择丙二醇（propylene glycol, PG）作为共溶剂，并加入碳酸氢钠作为碱化剂和依地酸钠（sodium edetate）作为螯合剂。最终确定的复溶溶液组成为PG/WFI/NaHCO₃/依地酸钠按60%/40%/2%/0.02%（体积/体积/质量/质量）混合。将冻干产品用20 mL该溶液复溶后，再用WFI稀释至40 mL，可得到pH约为9的澄清稳定溶液。在最低剂量（0.5 mg/40 mL）和最高剂量（32 mg/40 mL）条件下，复溶稀释后6小时内纯度均不低于98.5%，满足临床使用要求。

本研究的主要结论是，通过在碱性TBA/WFI溶液中进行冷冻干燥，并使用由丙二醇、注射用水、碳酸氢钠和依地酸钠组成的复溶溶液，可以获得稳定的EO-9膀胱灌注制剂。该研究证明了TBA作为冻干共溶剂在提高药物溶解度、改善稳定性、加快升华速率和缩短冻干周期方面的多重优势。同时，研究揭示了碳酸氢钠和甘露醇对TBA水合物及甘露醇结晶的抑制作用，以及退火步骤在促进TBA完全结晶和形成甘露醇δ多晶型中的作用。研究结果为EO-9的后续临床研究提供了可行的制剂方案，目前基于该冻干制剂和复溶溶液的Ⅱ期临床研究正在进行中。