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研究报告：基于HPLC-高分辨质谱与串联质谱的麦洼牦牛与犏牛乳中A1型和A2型β-酪蛋白分析

一、研究作者与发表信息
本研究由Yutian Chen、Yiping Ren、Lili Wang和Zhongping Huang共同完成，分别来自浙江工业大学化学工程学院（Zhejiang University of Technology）和清华大学长三角研究院分析测试中心（Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University）。研究论文发表于《Journal of Separation Science》2021年5月第44卷第9期，标题为“Analysis of A1-type and A2-type β-casein in Maiwa yak and pien-niu milk by HPLC-high-resolution MS and tandem MS”。

二、学术背景与研究目标
β-酪蛋白是牛乳中主要的蛋白质成分之一，占乳蛋白总量的约35%。其天然变体A1型和A2型因第67位氨基酸（组氨酸H或脯氨酸P）的差异而区分。A1型β-酪蛋白在消化过程中可能生成β-酪啡肽-7（BCM-7），而A2型则不会。已有研究表明，BCM-7可能与某些健康问题相关，如I型糖尿病和乳糖不耐受。

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原特有的牛种，其乳中蛋白质含量显著高于普通牛乳。为提高产奶量，当地牧民常将牦牛与高产奶牛（如荷斯坦牛）杂交，获得犏牛（pien-niu）。然而，杂交可能改变乳蛋白的组成，尤其是β-酪蛋白的变体分布。因此，本研究旨在开发一种基于肽段的高效液相色谱-高分辨质谱（HPLC-HRMS）与串联质谱（MS/MS）联用方法，定量分析牦牛、犏牛及普通牛乳中A1型和A2型β-酪蛋白的含量，并比较其差异。

三、研究流程与方法
1. 样本收集与处理
- 研究对象：45份乳样，包括23份麦洼牦牛乳、10份犏牛乳和12份普通牛乳（荷斯坦牛、西门塔尔牛和娟珊牛）。
- 样本处理：乳样稀释后，加入同位素标记肽段作为内标，经二硫苏糖醇（DTT）还原和碘乙酰胺（IAA）烷基化处理，再用胰蛋白酶（trypsin）酶解4小时，终止反应后离心取上清液进行质谱分析。

1. 肽段筛选与定性

   • 使用超高效液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Orbitrap HRMS）对酶解产物进行全扫描和二级质谱分析。
     
   • 通过Proteome Discoverer 2.1软件筛选与A1型和A2型β-酪蛋白对应的特异性肽段（含第67位氨基酸的序列）。
     
   • 确认肽段：A1型肽段（序列含H）和A2型肽段（序列含P），并通过碎片离子（如b22+、y13+）验证其序列。
     

2. 定量方法建立

   • 采用多反应监测（MRM）模式，选择+4价母离子（A1型m/z 1340.8，A2型m/z 1330.8）和定量子离子（y13+，m/z 1428.5）。
     
   • 使用同位素标记肽段（含13C6-15N亮氨酸）作为内标，校正检测信号。
     
   • 方法验证：线性范围（A1型52–4100 nmol/L，A2型48–3900 nmol/L）、检测限（A1型4.8 nmol/L，A2型3.7 nmol/L）和回收率（93.3–114.4%）。
     

3. 样本分析

   • 对45份乳样进行定量检测，计算A1型和A2型β-酪蛋白的含量及总β-酪蛋白含量。
     

四、主要研究结果
1. 方法学性能
- 线性相关系数（r²）>0.99，日内和日间精密度（RSD）分别为0.2–3.6%和%，表明方法稳定可靠。

1. β-酪蛋白含量比较

   • 牦牛乳和犏牛乳中总β-酪蛋白含量（均值分别为14.6 g/L和14.4 g/L）显著高于普通牛乳（11.6 g/L）。
     
   • 所有牦牛乳样本仅含A2型β-酪蛋白，而犏牛和普通牛乳中A1型与A2型共存（部分样本仅含一种变体）。
     

2. 变体分布差异

   • 犏牛乳的β-酪蛋白变体分布更接近普通牛乳，提示杂交可能引入A1型变体，削弱牦牛乳仅含A2型的优势。
     

五、研究结论与价值
本研究首次建立了基于肽段的HPLC-HRMS/MS方法，精准定量乳中A1/A2型β-酪蛋白。结果表明：
1. 科学价值：揭示了牦牛乳的独特蛋白质组成，为高原乳资源的功能性研究提供数据支持。
2. 应用价值：为乳品质量监控和杂交育种策略（如选育仅含A2型变体的犏牛）提供技术依据。

六、研究亮点
1. 方法创新：结合高分辨质谱与同位素内标，解决了完整蛋白定量难题。
2. 发现独特性：首次证实麦洼牦牛乳仅含A2型β-酪蛋白，提示其潜在健康优势。

七、其他价值
研究还指出，未来可通过选育A2型纯合子奶牛与牦牛杂交，进一步优化犏牛乳的蛋白质组成。