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鼓动中枢调控网络与咳嗽样防御行为的研究

第一部分：研究作者及机构信息

本研究由Noam Gannot、Xingyu Li、Chrystian D. Phillips、Ayse Bilge Ozel、Karin Harumi Uchima Koecklin、John P. Lloyd、Lusi Zhang、Katie Emery、Tomer Stern、Jun Z. Li和Peng Li等研究者完成，其中部分主要参与者分别隶属于美国密歇根大学（University of Michigan）的生命科学研究所、牙科学院及医学院。研究发表于《Nature Neuroscience》期刊，文章DOI为10.1038/s41593-024-01712-5。

第二部分：学术背景与研究目的

本研究所属领域主要为神经科学与呼吸生理学，核心内容是探讨神经中枢如何调控咳嗽这一重要的防御行为。咳嗽作为一种关键的呼吸行为，能够排出异物和病原体，从而保护呼吸系统。然而，目前学界对咳嗽调控神经回路的分子及细胞学机制了解甚少，尤其是在病理性干咳等状态下，这种机制可能出现过度敏感，影响患者生活质量。本研究旨在揭示小鼠大脑孤束核（nucleus of the solitary tract，NTS）中异质性神经元亚群在咳嗽样行为中的作用，解析其参与咳嗽样序列运动的神经回路及分子机制，并探索可应用于治疗咳嗽的潜在靶点。

第三部分：研究流程与实验方法

为了研究咳嗽样防御行为的神经回路，本研究采用了多层次、多阶段的实验设计。以下为具体流程：

1. 单细胞RNA测序研究NTS神经元的异质性 研究首先利用单细胞RNA测序技术对小鼠孤束核（NTS）的神经元进行分子水平的异质性分析。通过10x Genomics平台，研究者从9378个细胞中筛选出5523个高质量细胞，最终识别出19种分子标志物定义的细胞簇。这些亚群进一步为研究NTS神经元的功能划分提供基础。

2. 呼吸行为功能筛查 通过光遗传学技术在特定分子标志物阳性的转基因小鼠中激活孤束核的不同神经元亚型（如表达tachykinin 1（TAC1）的神经元），记录其呼吸行为，包括咳嗽样行为的产生。这些实验通过将携带Cre依赖性光敏通道蛋白（Channelrhodopsin-2，ChR2）表达的腺相关病毒（AAV）注射到小鼠孤束核中实现。

3. 咳嗽行为分类与算法分析 为了区分咳嗽样行为和打喷嚏等其他呼吸防御反射，研究者设计了特定实验，例如利用化学刺激物辣椒素（capsaicin）诱导小鼠产生咳嗽样行为，同时结合线性支持向量机（linear support vector machine, SVM）分类技术，对呼吸波形进行了高精度（98.08%准确率）分类。

4. 神经回路溯源实验 研究进一步通过追踪技术，如逆行性腺相关病毒和狂犬病毒示踪，结合分子标志物分析，定位TAC1神经元的上游输入以及其突触连接的下游区域，包括脑干腹外侧的核团，如疑核（nucleus ambiguus, NA）及尾侧腹呼吸群（caudal ventral respiratory group, CVRG）。

5. 神经元功能验证实验 为了验证TAC1神经元在咳嗽样行为中的功能，研究使用基因灭活（如通过AAV-DIO-TACAsp3导致这些神经元凋亡）和化学遗传学抑制（DREADDs技术）进行功能干预，观察是否会影响由辣椒素等诱导的咳嗽。

6. 分析突触信号传递及分子调控 研究通过基因敲除实验，探讨谷氨酸（glutamate）以及TAC1基因编码的神经肽（例如Substance P）在咳嗽反射中的作用，最终揭示快速性突触传递是TAC1神经元调控咳嗽的主要机制。

第四部分：研究结果

研究的主要发现如下：

1. NTS神经元异质性及咳嗽神经亚群 通过单细胞RNA测序，识别出孤束核（NTS）内的19个神经元亚型，其中TAC1阳性神经元与咳嗽样行为密切相关。这些神经元在辣椒素等引发的咳嗽样反应中被显著激活。

2. TAC1神经元控制咳嗽样行为 光遗传学实验表明，激活TAC1神经元足以诱导小鼠咳嗽样呼吸行为，其呼吸波形表现与化学刺激诱导的咳嗽相似。反之，抑制或凋亡这些神经元则显著减少了咳嗽样行为发生，但对其他呼吸模式如叹气、正常呼吸及缺氧呼吸的影响甚微。

3. 上下游神经回路组成 使用病毒示踪技术验证了孤束核TAC1神经元接收自迷走神经节（vagal ganglion）化学感受和机械感受纤维的直接突触输入，并将下行突触投射到脑干腹外侧的疑核和尾侧腹呼吸群，分别调控咳嗽的压缩期和排出期。

4. 快速性神经传递机制 功能基因敲除实验证明，TAC1神经元释放的谷氨酸在咳嗽反射中至关重要，而TAC1基因编码的神经肽（如Substance P）对咳嗽反射的影响有限。

第五部分：研究结论及意义

本研究通过全面多维的实验设计，证实小鼠存在一种由孤束核TAC1神经元主导的咳嗽样防御行为调控网络。其神经回路通过快速谷氨酸信号传递，协调迷走神经输入及脑干腹外侧输出核的相互作用，完成复杂的呼吸防御反射。研究展示了该机制的分子特异性和功能专一性，同时揭示了其在病理性干咳状态中的潜在靶点。

科学意义方面，本研究深化了对呼吸中枢调控网络的分子与细胞学解析，拓宽了关于咳嗽这一跨物种保存的生命现象的认知；应用价值方面，其成果为设计更高效的抗咳药物铺平了道路。

第六部分：研究亮点

1. 首次解析咳嗽的神经模块化控制机制：证实孤束核TAC1神经元同时调控咳嗽不同运动相位的核心模块。
2. 高精度行为分类技术：通过SVM优化的咳嗽波形分类技术奠定了行为解析方法的可靠性。
3. 明确的分子靶点及神经递质机制：发现谷氨酸而非TAC1神经肽在咳嗽反射中发挥关键作用。

第七部分：附加价值

尽管本研究的对象为小鼠，其调控机制与其他动物乃至人类可能具有广泛保守性。这为未来的跨物种研究（包括人类模型）提供了比较生物学视角，也为治疗病理性干咳等相关疾病提供了新的理论依据和技术思路。