本报告介绍的是一项发表于《美国国家科学院院刊》（PNAS）上的原创性研究。以下为该研究的详细学术报告。
一、研究作者、机构与发表信息
该研究的主要完成人为周启银（Qiyin Zhou）和于洪飞（Hongfei Yu）（并列第一作者），通讯作者为孙毅（Yi Sun）教授。研究团队来自浙江大学医学院第二附属医院癌症研究所、浙江大学转化医学研究院等多个附属机构。该论文于2024年7月3日在线发表于国际著名学术期刊《PNAS》（2024, Vol. 121, No. 28, e2320655121）。
二、研究背景与目的
细胞死亡是维持机体正常发育和稳态的基础，其失调与包括癌症在内的多种人类疾病密切相关。铁死亡（ferroptosis）作为一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的、独特的新型调节性细胞死亡方式，因其能选择性地杀伤特定类型的癌细胞，在克服癌症治疗耐药性方面展现出巨大潜力而备受关注。
溶质载体家族7成员11（SLC7A11）是细胞膜上胱氨酸/谷氨酸反向转运体（System xc-）的关键转运亚基，负责将细胞外的胱氨酸（cystine）转运至胞内。进入细胞的胱氨酸被还原为半胱氨酸，后者是合成重要抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）的限速底物。GSH随后被谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）利用，清除膜脂上的脂质过氧化物，从而阻断铁死亡。因此，SLC7A11是铁死亡的核心调控因子。尽管SLC7A11的作用至关重要，但其蛋白质稳定性在生理条件下如何被调控，特别是由哪对E3泛素连接酶（E3 ligase）和去泛素化酶（deubiquitylase, DUB）协同介导，一直悬而未决。
本研究旨在探究在环境胱氨酸水平变化的生理条件下，SLC7A11的蛋白稳定性是如何被精确调控的，并阐明这一调控机制在铁死亡和肿瘤发生发展中的生物学意义。
三、研究流程与方法
本研究遵循了从现象观察到机制解析，再到体内外功能验证和临床相关性的经典研究路径，主要分为以下几个关键步骤：
1. 发现CRL3失活导致SLC7A11积累并促进胱氨酸摄取 研究者首先使用NEDD8活化酶（NAE）的小分子抑制剂MLN4924处理多种乳腺癌细胞系（如MDA-MB-231, BT549等），发现抑制拟素化（neddylation）能显著降低培养基中的胱氨酸水平，表明胱氨酸摄取增加。随后，他们证实MLN4924能以时间和剂量依赖的方式，显著上调SLC7A11的蛋白水平，并适度影响其伴侣蛋白SLC3A2的水平。通过siRNA敲低NAE的催化亚基NAEβ以及使用另一种NAE抑制剂TAS4464，排除了药物的脱靶效应。为定位负责SLC7A11降解的特定Cullin-RING连接酶（CRL），研究者系统地敲低了所有Cullins家族成员（CUL-1, -2, -3, -4A, -4B, -5），发现只有敲低Cullin-3（CUL-3）或使用其特异性抑制剂DI-1859，才能模拟MLN4924的效果，导致SLC7A11蛋白积累并增加胱氨酸摄取。免疫共沉淀（Co-IP）实验进一步证实SLC7A11与CUL-3存在特异性结合。此步骤明确了CRL3是负责SLC7A11泛素化降解的主要E3连接酶复合体。
2. 鉴定KCTD10为CRL3识别SLC7A11的底物受体亚基 为找到CRL3复合体中直接识别SLC7A11的底物受体亚基，研究者对13个具有潜在抑癌功能的CRL3底物受体进行了siRNA筛选。结果发现，敲低KLHL13、KLHL25和KCTD10能增加SLC7A11水平，但只有KCTD10能在体内外实验中与SLC7A11发生稳健的相互结合。通过构建一系列截短突变体，他们精细地绘制了结合区域的图谱：SLC7A11的N端第1-43位氨基酸负责结合KCTD10，而KCTD10的C端功能域是其结合SLC7A11所必需的。功能实验表明，敲低KCTD10导致内源性SLC7A11蛋白积累，而不会显著影响其mRNA水平；反之，过表达KCTD10则降低SLC7A11蛋白水平。由此，研究者确定KCTD10即为靶向SLC7A11的CRL3底物识别亚基。
3. 解析CRL3-KCTD10复合体对SLC7A11的泛素化与降解机制 研究者进一步通过在体和体外的泛素化实验，证实CRL3-KCTD10是SLC7A11的活性E3泛素连接酶。仅野生型KCTD10，而非其丧失CUL-3或底物结合能力的突变体，能促进SLC7A11的多聚泛素化。通过使用不同类型的泛素突变体，研究揭示KCTD10主要催化SLC7A11发生K48连接类型的多聚泛素化链，这是经典的蛋白酶体降解信号。蛋白半衰期实验（使用蛋白质合成抑制剂放线菌酮，CHX）显示，敲低KCTD10显著延长了SLC7A11的半衰期，而过表达则缩短。这些结果有力地证明了SLC7A11是CRL3-KCTD10 E3连接酶的一个真实底物，被其泛素化后经蛋白酶体途径降解。
4. 鉴定USP18为SLC7A11的去泛素化酶 一个蛋白质的稳态通常由E3连接酶和去泛素化酶共同决定。为找到稳定SLC7A11的DUB，研究者筛选了一系列DUBs，发现只有泛素特异性蛋白酶18（USP18）能显著去除SLC7A11上的多聚泛素链。通过体内外Co-IP和去泛素化实验，确认了USP18与SLC7A11的直接相互作用和去泛素化活性。结构定位分析揭示，两者的相互作用分别依赖于USP18的内部结构域（第51-150位氨基酸）和SLC7A11的N端结构域。功能上，敲低USP18降低SLC7A11蛋白水平并缩短其半衰期；而过表达野生型USP18（而非其酶失活突变体USP18-C64S）则稳定SLC7A11并延长其半衰期。利用CRISPR-Cas9技术敲除USP18的MDA-MB-231细胞，同样显示出SLC7A11蛋白水平下降、半衰期缩短和泛素化增强。这些结果证实USP18是SLC7A11的一个真正的去泛素化酶，对其进行翻译后稳定。
5. 阐明胱氨酸环境对KCTD10-USP18轴的协调调控 为探究这一调控机制的生理条件，研究者检测了不同营养胁迫下三种蛋白的水平。结果发现，胱氨酸剥夺会导致SLC7A11和USP18的蛋白水平时间依赖性升高，而KCTD10的蛋白水平则显著下降。这种调控是动态和可逆的，重新补充胱氨酸后可以恢复。更重要的是，在胱氨酸饥饿条件下，先前报道的SLC7A11的其它E3连接酶（如TRIM26, SOCS2）和去泛素化酶（如OTUB1）的水平并未发生变化，凸显了KCTD10-USP18轴的特异性。机制上，胱氨酸剥夺削弱了SLC7A11与KCTD10的结合，同时增强了其与USP18的相互作用，从而双重保障SLC7A11的积累，以增强细胞对胱氨酸的摄取。
6. 验证KCTD10-USP18轴通过SLC7A11调控铁死亡和肿瘤生长 在功能层面，研究者证实KCTD10敲低通过上调SLC7A11，抑制了由胱氨酸剥夺、铁死亡诱导剂Erastin或RSL3诱导的铁死亡，赋予癌细胞对铁死亡抗性。相反，USP18敲低则加速SLC7A11降解，从而增强了癌细胞对铁死亡的敏感性。拯救实验进一步证实，这些效应均是通过靶向SLC7A11实现的，如共敲低SLC7A11可逆转敲低KCTD10带来的保护效应，而过表达SLC7A11则能挽救敲低USP18造成的细胞死亡。在临床样本分析中，与人乳腺癌癌旁正常组织相比，肿瘤组织中SLC7A11和USP18蛋白水平显著升高，而KCTD10水平显著降低，两者与SLC7A11的表达水平分别呈负相关和正相关。同时，肿瘤组织中的胱氨酸丰度也显著低于正常组织，表明SLC7A11的积累促进了胱氨酸的快速代谢消耗。最后，在体内外治疗实验中，将拟素化抑制剂MLN4924与SLC7A11抑制剂IKE（一种Erastin衍生物）联合使用，对比单药处理，能最有效地抑制乳腺癌细胞系的体外活力和体内异种移植瘤的生长。
四、研究主要结果
本研究的主要结果清晰且环环相扣。首先，多项实验结果一致表明，药物抑制拟素化或基因敲低CUL-3均能导致SLC7A11蛋白显著积累，伴随胱氨酸摄取增强，首次将CRL3与胱氨酸代谢和铁死亡的关键蛋白SLC7A11联系起来。其次，通过系统的筛选和验证，成功鉴定出KCTD10是CRL3复合体中负责识别和降解SLC7A11的特异受体亚基，并确定了其催化的K48类型的降解性泛素化，这填补了SLC7A11蛋白稳定性调控上游E3连接酶的知识空白。第三，发现并证实USP18是SLC7A11的专一去泛素化酶，负责去除其泛素化链以增强蛋白稳定性，构成了一个完整的KCTD10(E3)-USP18(DUB)功能调控对。第四，也是最关键的发现，揭示了这一调控轴的生理意义：即环境中的胱氨酸浓度可动态地、可逆地双向调控KCTD10和USP18的蛋白水平及其与底物的结合能力。胱氨酸匮乏时，E3连接酶KCTD10减少且与底物亲和力下降，而DUB酶USP18增加且与底物结合增强，这种双重调控确保了SLC7A11的最大化积累，以增强细胞在逆境下的胱氨酸摄取能力。第五，体内外功能实验证实，KCTD10-USP18轴通过调节SLC7A11蛋白水平，最终控制着癌细胞对铁死亡的敏感性。最后，临床相关性分析和治疗实验表明，在乳腺癌组织中，KCTD10低表达/USP18高表达与SLC7A11高表达及胱氨酸耗竭显著相关，且联合抑制拟素化和SLC7A11在临床前模型中展现出强大的抗肿瘤协同效应。
五、研究结论与价值
该研究最终构建了一个精确调控SLC7A11蛋白稳定性和铁死亡的工作模型：在胱氨酸充足时，CRL3-KCTD10 E3连接酶泛素化并降解SLC7A11；而在胱氨酸饥饿时，该连接酶活性降低，同时去泛素化酶USP18的活性增强，导致SLC7A11蛋白积累，从而增加胱氨酸的摄取和消耗，最终抑制铁死亡、促进癌细胞存活。这项研究的科学价值在于，它首次完整地阐明了SLC7A11在应对环境胱氨酸变化时，其蛋白稳定性通过一对特定的E3连接酶（CRL3-KCTD10）和去泛素化酶（USP18）实现动态协同调控的分子机制，为SLC7A11的翻译后调控领域贡献了关键性的新认知。其应用价值在于，该研究不仅揭示了多项肿瘤中SLC7A11蛋白上调的可能原因，更重要的是，为基础研究向临床转化提供了新策略和坚实的理论依据——即联合使用拟素化抑制剂（如MLN4924/Pevonedistat）和SLC7A11抑制剂（如IKE），通过协同致死效应显著增强抗癌疗效，为克服单药治疗的局限性、开发更有效的抗癌联合疗法指明了方向。
六、研究亮点