这篇研究报告的主要作者是来自山东第一医科大学、山东省医学科学院医学科技创新中心的Guangzhe Zheng, Wanqi Ma, Quanshu Wang, Shuping Zhang，以及来自中国医学科学院北京协和医院基本外科的Shaobo Chen, Ge Chen, Shuguang Chen。该研究于2024年11月14日在线发表于学术期刊 Advanced Science 上。

本研究属于肿瘤学与生物医学信息学的交叉领域，具体聚焦于甲状腺癌中最常见的亚型——乳头状甲状腺癌（Papillary Thyroid Cancer, PTC）的肿瘤内空间异质性和进化机制。研究的开展基于以下背景和动机：尽管PTC通常被认为是一种惰性、预后良好的癌症，但复发和转移仍然是影响其临床结局和导致患者死亡率上升的关键问题。传统的诊断方法存在显著局限：基于形态学的分类系统缺乏针对特定亚型的明确标准，而基于基因突变（如BRAF、RAS）的分子诊断则因PTC整体突变率较低而面临高噪音比的挑战。更重要的是，无论是形态学还是传统的批量样本分子分析，都极大地丢失了肿瘤内部的异质性信息。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术能够解析这种异质性，但它丧失了细胞的空间位置信息；而新兴的空间分辨转录组学（Spatially-resolved Transcriptomics, SRT）技术能保留空间信息，但其分辨率通常处于“点”（spot）水平，每个点包含多个细胞的混合信号。因此，本研究旨在通过整合scRNA-seq与更高分辨率的SRT技术，将转录组信息与局部形态学特征关联起来，以深入阐述PTC空间异质性、恶性进展和转移的潜在机制。具体目标包括：揭示PTC在原发性肿瘤组织内的空间进化路线，识别与恶性肿瘤和转移相关的基因足迹（gene footprints），并探究关键驱动事件，如铁死亡（ferroptosis）抵抗在PTC进化中的作用。

本研究的工作流程详细且系统，主要包含以下几个步骤： 第一步：患者样本采集与处理。 研究纳入了两名携带BRAF V600E突变的PTC患者：患者#1伴有淋巴结转移，患者#2无转移。从每名患者身上采集了三种组织：原发性肿瘤组织、匹配的癌旁组织以及淋巴结组织。所有样本均分为两部分，一部分用于scRNA-seq建库，另一部分用于SRT分析。用于SRT的组织块被包埋、冷冻切片并放置在Visium芯片上。所有操作均获得了伦理委员会的批准和患者的知情同意。 第二步：单细胞RNA测序（scRNA-seq）与数据分析。 共6个样本使用10x Genomics Chromium平台进行scRNA-seq。原始数据通过CellRanger流程比对到人类基因组（hg38），并利用Seurat软件包进行后续生物信息学分析。质量控制后，共获得21，060个细胞和17，601个基因。通过已知的细胞标志物，这些细胞被注释为22个主要细胞簇，归属于五大类：T细胞、B细胞、髓系细胞、基质细胞以及一个上皮细胞与PTC细胞的混合簇。分析确认了患者#1的淋巴结组织中存在PTC细胞（0.9%），证实了转移的发生，而患者#2的淋巴结中则没有。同时，研究发现PTC组织中存在高水平的免疫细胞浸润。 第三步：空间分辨转录组学（SRT）与数据整合分析。 使用升级的Visium技术（分辨率55 μm，约5000个点）对四份组织（两名患者的肿瘤和癌旁组织）进行分析。共获得6862个空间点。关键的技术整合步骤是：将scRNA-seq中已注释的细胞簇作为参考，通过Seurat的“锚点”转移方法，投影到SRT的空间点上，从而在保留空间位置的同时，赋予每个点可能的细胞类型组成信息。这种方法将转录组特征与H&E染色显示的形态学特征直接关联起来。分析显示，66.3%-83.5%的点被归类为上皮或PTC点，其余为成纤维细胞、免疫细胞等。通过无监督聚类，PTC点进一步被划分为6个主要的形态学点簇（C1-C6），其中C2-C4仅存在于有转移的患者#1肿瘤中，而C5-C6仅存在于无转移的患者#2肿瘤中，体现了空间异质性。 第四步：空间轨迹推断与进化路线分析。 为了重构PTC细胞在肿瘤空间内的进化路径，研究使用stLearn软件包对患者#1的肿瘤组织进行了空间轨迹推断分析。结果揭示了两种空间进化路线：一条是位于肿瘤组织边缘的上皮细胞区域进化成经典的恶性PTC点簇C3；另一条是已有的PTC点簇C1进化成另一个PTC点簇C4。研究进一步提取了参与每条进化路线的“感兴趣区域”（ROI），并分析了驱动基因和信号通路。 第五步：恶性与转移基因足迹的鉴定与功能验证。 为了追踪患者#1中转移至淋巴结的PTC细胞的来源，研究反向操作：将SRT鉴定的上皮和PTC点投影回scRNA-seq的上皮和PTC细胞参考上。通过比较不同来源（SRT原生的C3点、scRNA-seq投影到肿瘤的C3点、投影到淋巴结的C3点）的差异表达基因，研究者筛选出两组基因：18个重叠基因被定义为“恶性足迹”，16个淋巴结特异非重叠基因被定义为“转移足迹”。随后进行了功能富集分析。为了验证这些足迹中基因的功能，研究选取了转移足迹中的关键基因Midkine（MDK）进行体外实验。利用BRAF V600E突变的人PTC细胞系B-CPAP，通过siRNA敲低MDK，并进行了划痕愈合实验、Transwell侵袭实验以及铁死亡诱导剂RSL3处理下的细胞活力测定，以验证MDK对细胞迁移、侵袭和铁死亡抵抗的影响。 第六步：铁死亡抵抗在PTC进化中的角色探究。 基于恶性与转移足迹功能分析的线索（脂质代谢相关通路仅在恶性足迹中富集），研究者假设铁死亡抵抗可能参与PTC进化。他们从公共数据库FerrdB中收集了39个铁死亡标志基因，首先在TCGA的甲状腺癌（THCA）数据集中验证了这些基因在正常、癌旁和癌组织中的表达差异。随后，在本研究的scRNA-seq数据中，分析了患者#1和患者#2肿瘤与癌旁组织中这些基因，特别是GPX4和FTH1的表达情况。 第七步：细胞-细胞相互作用分析。 使用CellChat软件包对SRT数据中的空间点进行了细胞间通信网络分析，以探究不同细胞类型（如PTC细胞、成纤维细胞、巨噬细胞）在肿瘤微环境中的相互作用，及其对PTC空间进化的潜在贡献。

本研究取得了一系列重要的结果： 在空间异质性方面，整合分析显示，伴有淋巴结转移的患者#1其原发性肿瘤组织具有更大的空间异质性，表现为更高的全局点多样性和更复杂的PTC点簇交织分布模式。C3（患者#1）和C6（患者#2）点簇在形态上表现出经典的PTC特征，如乳头状纤维血管核心和外周恶性上皮细胞。 在进化驱动机制上，空间轨迹分析证实了多路线进化的存在。对进化路线的驱动事件分析发现，在上皮细胞向C3恶性PTC进化（epithelial_ROI→C3）的路线中，三羧酸（TCA）循环、呼吸电子传递、ATP合成等有氧代谢相关通路显著上调；而mRNA翻译、蛋白质合成以及无义介导的mRNA降解等通路显著下调，后者可能由GCN2响应氨基酸缺乏所介导。在PTC细胞内部的进化路线（C1_ROI→C4）中，则主要表现为这些蛋白质合成相关通路的普遍下调。这表明，增强的有氧代谢（支持了癌症中的“反向Warburg效应”）可能驱动了向恶性肿瘤的转化，而抑制mRNA翻译和蛋白质合成以及活跃的细胞间相互作用（如FN1-ITGA3/ITGB1、EFNA1-EPHA4等配体-受体对介导）可能是PTC肿瘤发生和内部进化所必需的。 在基因足迹方面，研究成功鉴定出两组基因足迹。“恶性足迹”和“转移足迹”的功能富集均涉及细胞外基质重塑、细胞器功能和细胞-细胞相互作用。不同的是，“转移足迹”还特异地与内质网应激和抗原呈递相关，而“恶性足迹”中富集的脂质代谢相关通路在“转移足迹”中未出现。体外实验验证表明，敲低转移足迹中的关键基因MDK能显著抑制B-CPAP细胞的迁移和侵袭能力，并且增强了细胞对铁死亡诱导剂RSL3的敏感性，提示MDK可能通过增强铁死亡抵抗来促进PTC细胞的生长和转移。 在铁死亡抵抗方面，分析显示，在伴有转移的患者#1中，其肿瘤组织相比癌旁组织，39个铁死亡标志基因以及GPX4、FTH1这两个关键抗铁死亡基因的表达普遍上调或受到抑制（表明铁死亡活性降低）。相反，在没有转移的患者#2中，这种变化模式不明显甚至相反。这强烈提示，获得铁死亡抵抗能力可能促进了PTC细胞的进化，尤其是与转移相关的恶性进展。 在细胞互作方面，分析发现C3和C4是主要的信号接收簇，而成纤维细胞是主要的信号发送簇，巨噬细胞也积极参与互作，揭示了肿瘤微环境中基质细胞与癌细胞之间的复杂通信网络。

本研究的结论是，通过整合scRNA-seq与高分辨率SRT技术，首次在空间和单细胞水平上系统揭示了PTC肿瘤内的高度空间异质性和多条空间进化路线。研究指出，有氧代谢增强、mRNA翻译抑制以及细胞间相互作用共同驱动了PTC的空间进化。研究者成功筛选出与PTC恶性和转移密切相关的两组基因足迹，并验证了MDK在促进侵袭和铁死亡抵抗中的作用。最后，研究提出了铁死亡抵抗是PTC进化，特别是转移过程中的一个关键贡献因素。这些发现深化了对PTC肿瘤内空间异质性和进化机制的理解，为开发更精准的诊断策略（如基于空间分子特征的诊断模型）和针对特定进化路线或铁死亡通路的新型治疗靶点提供了重要的理论依据和数据支持。

本研究的亮点在于：方法学创新：开创性地整合了高分辨率（55μm）SRT与scRNA-seq，将单细胞转录组信息精准锚定在组织形态学空间上，克服了单一技术的局限性，为解析实体瘤的空间生物学提供了强有力的工具范式。科学发现新颖：首次在PTC中描绘了明确的空间进化路线图，并详细阐述了其背后的多组学驱动事件（代谢、翻译、细胞互作），将宏观形态与微观分子机制紧密联系。提出新的机制假说：通过多组学数据关联和实验验证，将“铁死亡抵抗”这一新兴的细胞死亡抵抗机制与PTC的恶性进化与转移联系起来，为理解PTC的进展和耐药提供了新的视角。具有转化潜力：筛选出的“恶性”与“转移”基因足迹不仅在PTC中得到验证，在TCGA的其他多种癌症中也显示出预测价值，显示了其作为泛癌种潜在生物标志物的可能。

此外，研究还对近期相关领域的研究进行了对比讨论，指出本研究在空间进化路线描绘、代谢驱动机制解析以及铁死亡抵抗角色探索方面的独特贡献，区别于其他专注于肿瘤微环境细胞组成、预后模型构建或治疗反应相关表型的研究，凸显了本研究的侧重点和深度。