本文的研究由Auburn University（奥本大学）营养科学系的Ifeoluwa A. Odeniyi、Bulbul Ahmed、Peter T. Abraham和Michael W. Greene，以及化学工程系的Benjamin Anbiah、Grace Hester和Elizabeth A. Lipke共同完成。该研究发表于 Adipocyte 期刊2024年第13卷第1期，文章编号为2414919，并于2024年10月1日被接收。
一、学术背景与研究目的
肥胖是全球范围内日益严重的公共卫生问题，在美国约有39.8%的成年人被认为患有肥胖症。肥胖与胰岛素抵抗（insulin resistance）和炎症（inflammation）密切相关，而这些病理状态会增加2型糖尿病、高血压、心血管疾病及某些癌症的发病风险。脂肪组织功能障碍会导致脂肪因子（adipokines）表达失调，例如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）和趋化因子配体2（CCL2，又称MCP-1）上调，而脂联素（adiponectin）下调。脂肪胰岛素抵抗的特征是胰岛素反应受损，导致葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）介导的葡萄糖摄取减少、糖原合成异常和脂解失调。
在体外模型中，3T3-L1成纤维细胞系是最常用的研究脂肪细胞分化与生物学特性的工具之一。分化后的3T3-L1脂肪细胞对胰岛素高度敏感，但TNF-α、缺氧（hypoxia）等多种肥胖相关因素均可诱导其产生胰岛素抵抗。已有研究表明，24小时的TNF-α与缺氧联合处理能够诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗，并且在转录水平上最接近饮食诱导的肥胖胰岛素抵抗小鼠的脂肪组织变化。然而，该模型存在一个关键问题：24小时的TNF-α处理会导致显著的脂肪细胞死亡，同时培养基中残留的重组TNF-α会干扰后续共培养实验。因此，本研究的主要目的是：1）确认TNF-α与缺氧联合处理诱导急性胰岛素抵抗和炎症的效果并评估细胞活力；2）探索通过缩短TNF-α处理时间，在保持炎症和胰岛素抵抗表型的同时提高细胞存活率，并建立可长期维持的体外模型，以便用于脂肪细胞与其他细胞（如癌细胞、单核细胞、肌细胞或肝细胞）的共培养研究。
二、研究的详细工作流程
本研究的工作流程主要包括以下几个环节：
3T3-L1细胞培养与分化：3T3-L1前脂肪细胞在含10%胎牛血清（FBS）和1×青霉素-链霉素的高糖DMEM中培养。待细胞生长至约120%融合后，加入含10 μg/ml胰岛素、1 μM罗格列酮、1 μM地塞米松和0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）的分化培养基（分化第0天）。3天后更换为含5 μg/ml胰岛素的维持培养基，第5天和第7天更换维持培养基，第9天更换为普通生长培养基。分化第10天的成熟脂肪细胞用于后续处理。
TNF-α/缺氧处理：为诱导胰岛素抵抗和炎症，成熟脂肪细胞在含0.1%牛血清白蛋白（BSA）和20 ng/ml重组大鼠TNF-α的低糖DMEM中培养，并置于1% O₂和5% CO₂的缺氧小室中。处理分为两组：一组为TNF-α处理24小时并在缺氧条件下孵育24小时（24 h TNF-α/24 h hypoxia）；另一组为TNF-α处理12小时后更换新鲜无TNF-α的低糖BSA培养基，再继续缺氧12小时（12 h TNF-α/24 h hypoxia）。对照组细胞在常氧条件下用低糖BSA培养基培养24小时。为检验长期维持效果，24小时处理后向各组加入4.5 g/L葡萄糖和10% FBS，继续培养至48小时和72小时。
细胞活力检测（Live/Dead染色）：采用Live/Dead® Viability/Cytotoxicity试剂盒，以钙黄绿素AM（Calcein AM）标记活细胞、乙锭同型二聚体-1（EthD-1）标记死细胞、Hoechst 33342标记所有细胞核。使用Echo Revolve荧光显微镜拍摄图像，利用ImageJ软件手动计数细胞核和死细胞数，按照公式“活细胞百分比 =（细胞核数 - 死细胞数）/ 细胞核数”计算细胞活力。
基因表达分析（RT-qPCR）：使用QIAzol试剂裂解细胞，采用Qiagen RNeasy Mini Kit提取总RNA。取1 μg RNA用SuperScript IV反转录酶合成cDNA。使用Power SYBR Green PCR Master Mix在QuantStudio 3实时PCR系统上进行RT-qPCR。检测的靶基因为胰岛素敏感性标志物*adipoq*和*slc2a4*（GLUT4），炎症标志物*il6*和*ccl2*，以*eef2*为内参基因，采用ΔΔCt法计算相对表达量。
炎症因子分泌检测（ELISA）：收集处理后的条件培养基，使用大鼠TNF-α、小鼠MCP-1和IL-6的Quantikine ELISA试剂盒，按照制造商说明检测分泌蛋白水平。
葡萄糖摄取实验（2-NBDG法）：将分化成熟的脂肪细胞培养于黑色24孔板中，处理后在无糖无血清培养基中洗涤，用100 nM胰岛素刺激20分钟。细胞松弛素B（Cytochalasin B, CytB）组用于检测非特异性葡萄糖摄取。加入100 μM荧光标记的脱氧葡萄糖类似物2-NBDG，37°C孵育20分钟，用冰冷PBS洗涤三次后，使用酶标仪在激发波长467 nm、发射波长542 nm处测量荧光强度。从胰岛素刺激或无刺激细胞的值中减去CytB组的非特异性转运值，数据以未刺激对照组的百分比表示。
免疫印迹（Western blotting）：用RIPA缓冲液裂解细胞并超声处理，BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品经10% SDS-PAGE电泳分离后转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭，分别与抗Akt和抗phospho-Akt（Ser473）一抗4°C孵育过夜，室温孵育二抗1小时。使用LI-COR成像系统扫描膜，ImageStudio软件分析条带强度。
统计分析：所有实验至少重复三次。数据经正态分布检验后，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey事后检验，p<0.05为差异有统计学意义。
三、主要研究结果
首先，研究确认了24小时TNF-α与缺氧联合处理能够显著诱导脂肪细胞胰岛素抵抗和炎症。单独使用20 ng/ml TNF-α或单独缺氧处理均能显著降低*adipoq*和*slc2a4*（GLUT4）的表达，其中单独缺氧使*adipoq*和*slc2a4*分别降至0.01±0.0倍和0.01±0.0倍。联合处理进一步使两个基因的表达降至接近0（分别为0.00±0.0和0.01±0.0）。在炎症基因方面，单独TNF-α或单独缺氧处理均未显著改变*ccl2*和*il6*表达，但联合处理使其分别显著增加14.98±1.25倍和8.82±0.47倍。葡萄糖摄取实验显示，对照组在胰岛素刺激下葡萄糖摄取增加2.60倍，而24小时TNF-α/缺氧处理组在有或无胰岛素刺激时均无显著差异，表明胰岛素刺激的葡萄糖摄取被完全抑制。Western blot结果显示，TNF-α/缺氧处理的脂肪细胞中胰岛素诱导的Akt Ser473磷酸化水平显著降低（p<0.001），进一步证实胰岛素信号通路受损。
其次，研究发现24小时TNF-α/24小时缺氧处理显著降低细胞活力，活细胞百分比明显低于对照组（p<0.001）。通过ELISA检测发现，在24小时处理期间，培养基中的重组TNF-α浓度始终维持在约2800 pg/ml的高水平，表明TNF-α在培养体系中持续存在。将TNF-α处理时间缩短至12小时后，更换新鲜培养基使重组TNF-α浓度在12小时时降至240.4±109.1 pg/ml，24小时时进一步降至189.8±34.8 pg/ml。相应地，12小时TNF-α/24小时缺氧组的活细胞百分比显著提高至74.2±2.4%，而24小时TNF-α/24小时缺氧组仅为40.0±4.6%（p<0.001）。重要的是，12小时处理组仍然保持了胰岛素抵抗和炎症表型：*adipoq*和*slc2a4*表达分别降至0.08±0.1倍和0.07±0.1倍，与24小时处理组无显著差异；*il6*和*ccl2*表达分别显著增加21±4倍和228±11倍（p<0.001），且与24小时处理组无显著差异。ELISA检测条件培养基发现，12小时处理组在24小时时分泌的MCP-1为1930±19.9 pg/ml，IL-6为20.5±1.7 pg/ml，显著高于未处理对照组的402.2±48.2 pg/ml和2.4±0.4 pg/ml（p<0.001）。葡萄糖摄取实验显示，12小时和24小时处理组之间胰岛素刺激葡萄糖摄取均被抑制，且两组间无显著差异。
第三，研究评估了该模型的长期维持能力。在24小时处理结束后加入4.5 g/L葡萄糖和10% FBS，继续培养至48小时和72小时。细胞活力方面，12小时TNF-α/24小时缺氧处理组在24小时、48小时和72小时的活细胞百分比分别为64.0±3.7%、57.6±1.6%和58.2±8.8%，不同时间点间无显著差异。基因表达方面，*adipoq*和*slc2a4*的下调在24小时时间点分别为0.03±0.0倍和0.02±0.0倍（p=0.001），并在48小时和72小时时间点持续维持。炎症基因*ccl2*在24小时时间点显著增加109.2±9.6倍（p<0.001），48小时时间点仍保持升高，但在72小时时间点下降至13.05±3.82倍，尽管仍显著高于对照组。更为重要的是，葡萄糖摄取实验显示，在48小时和72小时时间点，12小时TNF-α/24小时缺氧处理组仍然对胰岛素刺激无反应，表明胰岛素抵抗表型可至少维持72小时。
四、结论与意义
本研究成功建立了一种改良的体外脂肪细胞炎症与胰岛素抵抗模型，其核心改进在于将TNF-α处理时间从24小时缩短至12小时，并在总缺氧时间保持24小时的前提下更换新鲜培养基以去除残留的重组TNF-α。这一改进显著提高了脂肪细胞的存活率，同时完整保留了炎症和胰岛素抵抗表型。更为关键的是，该模型在加入葡萄糖和FBS后，能够将胰岛素抵抗状态维持至处理后72小时，且未对细胞活力造成进一步损害。
本研究的科学价值在于：首先，解决了传统模型因细胞死亡过多而无法用于长期共培养实验的问题；其次，通过去除培养基中残留的重组TNF-α，避免了其对共培养体系中其他细胞的直接干扰，从而使得该模型可以用于研究肥胖相关的胰岛素抵抗和炎症脂肪细胞与癌细胞、单核细胞、肌细胞或肝细胞之间的代谢串扰。此外，本研究还证实了12小时与24小时TNF-α处理在诱导胰岛素抵抗和炎症方面具有等效性，提示TNF-α触发的信号通路在12小时内已经充分激活。这一发现为今后优化体外脂肪组织模型提供了实验依据，也为肥胖相关代谢疾病的机制研究和药物筛选提供了更为可靠的细胞平台。尽管该模型仍存在表型较为严重、与人类胰岛素抵抗状态不完全一致等局限性，但其在共培养研究中的应用潜力值得期待。