本研究由来自荷兰癌症研究所（The Netherlands Cancer Institute）的Thomas W. Battaglia、Iris L. Mimpen、Joleen J.H. Traets、Joris van de Haar以及Emile Voest等研究人员完成，通讯作者为Emile Voest。论文于2024年4月25日发表于《Cell》期刊，题为“A pan-cancer analysis of the microbiome in metastatic cancer”。
一、学术背景与研究目的
微生物组（microbiome）是定植于人体多个生态位的复杂微生物群落，在调节宿主免疫系统及抗癌治疗反应中发挥重要作用。既往研究已证实原发性肿瘤（primary tumors）内存在复杂的微生物群落，且肠道微生物可调节免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）治疗和传统化疗的疗效。然而，转移灶（metastases）作为实体瘤死亡的主要原因和系统性治疗的关键靶点，其内微生物组的特征及临床意义尚不清楚。该研究旨在利用大规模泛癌种转移性肿瘤活检样本，整合宏基因组学（metagenomics）、基因组学（genomics）、转录组学（transcriptomics）及临床数据，系统刻画转移性肿瘤微生物组的分布、多样性、与肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的关联及其对免疫治疗疗效的影响。
二、研究流程与实验方法
研究核心流程包含五个主要步骤。第一步为微生物组挖掘：从Hartwig医学基金会（Hartwig Medical Foundation）队列中获取4,164例治疗前转移性肿瘤的全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）数据，覆盖26种癌症类型。通过提取未比对到人类基因组的序列（unmapped reads），应用Kraken2和PathSeq两种独立的计算方法在属水平（genus level）鉴定微生物，并在过滤技术污染和低频类群后，共鉴定出165个属。同时采用基于宏基因组组装（metagenomic assembly）的方法在物种水平（species level）进行表征，利用metaSPAdes进行组装，结合VAMB和MetaBAT2进行分箱（binning），通过CheckM2评估基因组质量，共获得514个接近高质量或中等质量的宏基因组组装基因组（metagenome-assembled genomes, MAGs）。此外，在部分匹配肿瘤组织中进行了16S rRNA扩增子测序以验证WGS来源的细菌谱。
第二步为微生物群落的塑造因素分析：研究首先通过方差分解确定解剖部位（anatomical site）对微生物组成的影响强于原发肿瘤组织来源。随后使用Aitchison距离和置换多元方差分析（PERMANOVA）比较不同癌种间微生物群落的差异，并校正活检部位、测序平台和来源医院等混杂因素。为研究缺氧与厌氧菌的关系，在2,358例具有匹配RNA测序数据的样本中利用Hallmark缺氧基因集进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA），并在一个包含31例人乳头瘤病毒（HPV）阴性头颈癌患者的外部验证队列中通过缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）免疫组化染色进行独立验证。此外，对191例微卫星不稳定（microsatellite instability, MSI）或稳定（microsatellite stable, MSS）的肿瘤进行基于图聚类的微生物群落分型分析。
第三步为微生物与肿瘤生物学关联分析：研究首先检验革兰氏阴性菌的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）负荷与Toll样受体4（TLR4）信号通路活化的关联，以及革兰氏阳性菌的脂磷壁酸（lipoteichoic acid, LTA）负荷与TLR2信号通路的关联，采用线性混合效应模型（linear mixed effect, LME）进行统计。随后使用自适应微生物组α多样性关联分析（adaptive microbiome α-diversity-based association analysis, AMIAD）方法，将微生物α多样性与PROGENy通路活性、TIDE免疫逃避特征、CIBERSORT解卷积的免疫细胞组成以及EcoTyper定义的细胞状态进行关联分析，所有分析均校正原发肿瘤部位、转移部位、测序平台和来源医院等混杂因素。
第四步为微生物群落的时间动态分析：研究纳入185对（来自173例患者的370次重复活检）配对转移性肿瘤活检，中位间隔7.5个月。比较同一病灶来源配对样本与随机样本间的Aitchison群落差异，并使用InStrain在菌株水平评估配对样本的相似性。同时将配对样本按治疗类型分为免疫治疗组（n=33）、靶向治疗组（n=34）和激素治疗组（n=19），使用betta_random框架比较治疗前后细菌丰富度（richness）的变化，并校正活检间隔时间、原发肿瘤部位和病灶状态。
第五步为具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）与免疫治疗疗效关联分析：在一个包含63例接受ICB单药治疗的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者队列中，使用ANCOMBC进行差异丰度分析，校正活检部位、测序平台和来源医院。随后在多变量Cox比例风险模型中，将具核梭杆菌的连续丰度与全基因组突变负荷、淋巴结转移状态、STK11和KEAP1耐药基因等变量共同纳入，评估其对总生存期（overall survival, OS）和无进展生存期（progression-free survival, PFS）的影响。同时在整个泛癌种队列中以相对丰度的第75百分位数为阈值将肿瘤分为梭杆菌高组和低组，进一步验证生存差异。
三、主要研究结果
在微生物组总体特征方面，研究发现在3,526例可评估样本中，49%（81/165）的属为革兰氏阴性菌，68%（112/165）为厌氧或兼性厌氧菌。细菌来源读段占总人类比对读段的比例在子宫癌和肾癌中较高，在原发性中枢神经系统（CNS）来源的癌症中较低；结直肠癌和肾转移灶的细菌负荷较高。生物多样性分析显示多数癌种具有较丰富且均衡的微生物群落，但CNS癌症的群落丰富度较低，结直肠转移灶多样性最高，头颈转移灶则以少数优势属为主。
在微生物群落塑造因素方面，解剖部位比原发肿瘤类型更能解释微生物组成的变异。GSEA分析显示，在低氧肿瘤中厌氧菌显著富集（normalized enrichment score, NES=1.72, p<0.001），而需氧菌则在富氧相关通路中富集（NES=-1.76, p<0.001）；这一结果在通过HIF-1α染色分层的独立头颈癌队列中得到验证。MSI肿瘤的微生物群落组成与MSS肿瘤显著分离（p=0.03），且MSS患者中具有MSI样群落类型的个体表现出显著升高的干扰素γ（IFN-γ）信号通路活性（p=0.003）。在宿主免疫关联方面，LPS负荷与TLR4信号通路活化显著相关（LME-p=0.02），LTA负荷与TLR2信号相关（LME-p=0.04）。高微生物多样性肿瘤表现出EGFR、TGF-β和TNF-α信号通路的激活，以及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）组织相关通路和抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）基因的富集。同时，高多样性肿瘤富集肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast, CAF）浸润和免疫排斥特征，并显著富集中性粒细胞、自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞和调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）等固有免疫细胞。特定菌种与免疫细胞功能状态的关联分析发现双歧杆菌（Bifidobacterium）与NK细胞功能状态正相关。
在时间动态方面，配对活检的细菌丰度总体相关性良好（中位Spearman r=0.52, IQR 0.45–0.61），同一病灶来源的配对样本群落相似性显著高于随机配对样本，菌株水平分析也证实了配对样本间的相似性增加。接受免疫治疗的患者中，治疗后细菌丰富度显著下降；且这种下降在获得部分缓解或疾病稳定的应答患者（n=14）中比疾病进展的无应答患者（n=9）更为显著。在免疫治疗应答患者中反复减少的细菌包括放线菌属（Actinomyces）、拟杆菌属（Bacteroidetes）、双歧杆菌属和普雷沃菌属（Prevotella）。在NSCLC免疫治疗队列中，梭杆菌属（Fusobacterium）的丰度与持久临床获益（durable clinical benefit, DCB）呈负相关（ANCOMBC p=0.045）。多变量Cox模型显示，梭杆菌丰度与OS和PFS降低显著相关（调整后风险比2.3, 95%CI 1.08–5.03）。在高梭杆菌组肿瘤中，细胞毒性活性、IFN-γ信号和MHC II类基因表达显著降低。
四、结论与研究价值
该研究首次建立了大规模泛癌种转移性肿瘤微生物组图谱，系统揭示了转移性肿瘤微生物组的组成特征及其与肿瘤生物学和免疫治疗的关联。研究证实了转移灶微生物群落在一定程度上随时间保持稳定，但免疫治疗可重塑其结构，且在应答患者中重塑更为明显。更重要的是，研究发现具核梭杆菌的丰度在NSCLC中可作为ICB疗效不良的预测指标。该研究的科学价值在于将肿瘤微生物组研究从原发肿瘤扩展到转移灶这一更具临床相关性的场景，并为理解宿主-微生物互作在肿瘤免疫中的作用提供了系统性的数据资源。其应用价值在于为开发以细菌为导向的辅助治疗策略提供了候选靶点和生物标志物，特别是针对具核梭杆菌的干预可能具有增强免疫治疗疗效的潜力。
五、研究亮点
本研究的主要亮点包括：第一，首次在超过4,000例转移性肿瘤活检中实现了物种水平的微生物组基因组表征，并组装获得514个MAGs；第二，发现厌氧菌在低氧肿瘤中的富集现象，并通过独立队列进行了验证；第三，建立了微生物多样性与肿瘤固有免疫细胞浸润（特别是中性粒细胞）之间的广泛关联；第四，利用纵向配对活检揭示了免疫治疗对肿瘤微生物群落的特异性重塑作用；第五，首次在转移性NSCLC中证实具核梭杆菌丰度与ICB疗效不良的独立关联。在方法学上，研究整合了基于比对和基于组装的两种宏基因组学策略，并结合了转录组、基因组和临床数据，形成了一个可供后续研究使用的综合性资源。研究也指出了局限性，包括仅包含转移性病灶而缺乏健康组织对照、低生物量可能导致低丰度细菌的漏检、以及发现仅为相关性而非因果性等。