关于VISTA是一种酸性pH选择性PSGL-1配体的研究报告

一、 研究作者、机构与发表信息

本项研究由来自百时美施贵宝、Five Prime Therapeutics以及Genoway等多家机构的科学家共同完成。第一作者为百时美施贵宝的Robert J. Johnston，通讯作者为同一机构的Alan J. Korman。这项原创性研究成果以论文形式发表于国际顶级学术期刊《Nature》（自然），具体刊载于2019年10月24日的第574卷。

二、 研究学术背景

本研究属于肿瘤免疫学与免疫检查点调控领域。在癌症患者体内，T细胞功能会受到多种共抑制受体的影响而失调。靶向细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）和程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）的阻断性抗体已成功用于部分逆转这种抑制，并成为越来越多恶性肿瘤的标准疗法。然而，肿瘤微环境如何通过其他通路抑制T细胞功能，仍有诸多未解之谜。

VISTA（V-domain Ig suppressor of T cell activation，V域免疫球蛋白T细胞激活抑制因子），也称为B7-H5、PD-1H等，是B7家族的一个配体，表达于循环和肿瘤内的髓系细胞上，在活化的淋巴细胞上低表达。前期研究表明，VISTA能在体外和自身免疫及癌症的临床前模型中抑制T细胞反应，并且被认为是患者对PD-1和CTLA-4免疫疗法产生耐药性的潜在介质。然而，由于对VISTA的对应受体（counter-receptor）及其功能机制缺乏深入了解，针对VISTA的治疗干预机会一直受限。

本研究的核心目标在于阐明VISTA在肿瘤微环境中的作用机制，特别是探索其与对应受体的相互作用是否受到肿瘤微环境特有条件的调节，并在此基础上开发新型的治疗策略。

三、 详细研究流程与方法

本研究包含了一系列严谨且递进的实验流程，综合运用了生物化学、结构生物学、细胞生物学、计算生物学和体内药效学等多学科技术手段。

1. pH选择性结合与功能的初步验证：

   • 研究对象：使用重组人VISTA多聚体或Fc融合蛋白，以及从健康供体血液中分离的人外周血单个核细胞（PBMC）、特定的淋巴细胞亚群（如活化的CD4+ T细胞）。
   • 实验方法：在不同pH值（酸性pH 6.0代表肿瘤微环境，中性pH 7.4代表生理环境）条件下，通过流式细胞术检测VISTA蛋白与免疫细胞的结合情况。同时，利用共培养系统（如与表达OKT3-scFv和VISTA的293T细胞共培养），评估不同pH下VISTA对T细胞增殖、IFN-γ产生和NF-κB磷酸化的抑制功能。
   • 创新方法：研究中筛选并利用了两种特性不同的单克隆抗体：VISTA.4（能阻断VISTA在酸性pH下与T细胞的结合）和VISTA.5（不能阻断）。通过对比这两种抗体对VISTA结合和功能的干预效果，初步确立了VISTA的功能具有pH选择性，且阻断其结合可逆转抑制。

2. VISTA结构与抗体作用机制解析：

   • 研究对象：重组人VISTA的免疫球蛋白可变（IgV）结构域，以及从免疫小鼠中筛选、并经过工程化改造的抗体（如VISTA.18）。
   • 实验方法：
     • 抗体工程与筛选：通过酵母展示和mRNA展示技术，从免疫文库中筛选抗体，并进一步通过定点突变和亲和力成熟，开发出对酸性pH具有高度选择性的抗体克隆（如VISTA.18），以及对pH不敏感的克隆（如VISTA.16）。
     • X射线晶体学：将VISTA的IgV结构域与VISTA.18抗体的抗原结合片段（Fab）共结晶，解析了其高分辨率三维结构（PDB ID: 6MVL）。这揭示了VISTA表面一个富含组氨酸（His）的环状结构是其关键功能界面，VISTA.18通过其互补决定区（CDR）的酸性氨基酸与这些组氨酸形成氢键，从而解释了该抗体的pH选择性。
   • 数据分析：结构比对显示，VISTA的IgV结构域相较于其他B7家族成员（如PD-L1）更为细长，且组氨酸残基集中分布在连接β链的环上。

3. VISTA对应受体的鉴定与表征：

   • 研究方法：采用配体受体捕获技术（TRICEPS），在酸性pH条件下，用VISTA-Fc作为“诱饵”从活的人CD4+ T细胞表面捕获并富集其结合蛋白，随后进行质谱分析。
   • 主要结果：质谱分析将P-选择素糖蛋白配体-1（P-selectin glycoprotein ligand-1， PSGL-1）鉴定为VISTA的主要结合蛋白。PSGL-1是一种已知的粘附和共抑制受体。
   • 验证与表征：
     • 体外结合实验：利用生物层干涉技术（BLI）和等温滴定量热法（ITC）证实，VISTA与PSGL-1在酸性pH下以高亲和力（Kd ~0.65-0.85 μM）和接近1:1的化学计量比结合，而在中性pH下结合微弱。
     • 细胞验证：通过CRISPR/Cas9基因敲除T细胞中的PSGL-1，显著降低了VISTA的结合；反之，在原本不结合VISTA的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中外源性表达PSGL-1，则使其获得在酸性pH下结合VISTA的能力。
     • 结合特异性：VISTA与PSGL-1的结合依赖于PSGL-1 N端的酪氨酸硫酸化修饰，但独立于其唾液酸路易斯X（sialyl-Lewis X）糖基化修饰，这与PSGL-1与其经典配体P-选择素的结合特征既有相似也有不同。

4. 结合界面的分子机制研究：

   • 研究方法：结合晶体结构信息，对VISTA表面关键的组氨酸残基（如H153， H154， H155， H98， H100）进行系统性突变（替换为丙氨酸、天冬氨酸或精氨酸），并评估突变体与PSGL-1的结合能力。
   • 实验结果：将H153/H154/H155突变为带负电的天冬氨酸完全消除了结合，突变为带正电的精氨酸则保留了酸性pH下的结合，但在中性pH下结合很弱。这表明这些组氨酸的质子化（带正电）是酸性条件下结合所必需的。进一步的五重组氨酸（H98， H100， H153， H154， H155）精氨酸突变，使VISTA获得了在中性pH下结合PSGL-1和T细胞的能力，模拟了组氨酸永久质子化的状态。
   • 计算模型：基于已知的PSGL-1/P-选择素结构和VISTA/VISTA.18结构，通过计算对接模拟了VISTA-PSGL-1复合物模型。模型显示，PSGL-1的硫酸化酪氨酸（如Y46， Y48）可能与VISTA质子化的组氨酸（如H153， H154）形成离子相互作用，从结构上解释了结合对pH和硫酸化的依赖性。

5. 体内功能验证与治疗潜力探索：

   • 动物模型：使用小鼠结直肠腺癌MC38模型、VISTA基因敲除（KO）小鼠以及人源化VISTA敲入（KI）小鼠。
   • 实验流程：
     • 药效评估：在荷瘤野生型小鼠中，评估抗小鼠VISTA阻断抗体单独使用或与抗PD-1抗体联用的抗肿瘤效果。结果显示，单药效果有限，但联合治疗能显著抑制肿瘤生长，甚至在一些小鼠中实现肿瘤完全消退，并伴随肿瘤内CD8+ T细胞浸润增加及PD-1等衰竭标志物表达下降。在VISTA-KO小鼠中观察到了类似的联合增效表型，证实了抗体的作用是阻断内源性VISTA功能。
     • 抗体药代动力学与靶向性：比较非pH选择性抗体（VISTA.16）和酸性pH选择性抗体（VISTA.18）在人源化VISTA KI小鼠及食蟹猴体内的代谢和分布。VISTA.16因在血液循环（中性pH）中也能结合VISTA，导致其血液平均滞留时间（MRT）极短（~4.1小时），并主要富集在表达VISTA的脾脏等淋巴器官。相反，VISTA.18在血液中几乎不结合VISTA，其MRT显著延长（小鼠71小时，食蟹猴717小时），并能选择性地在酸性肿瘤微环境中积累。
     • 治疗验证：尽管药代动力学特性迥异，但在人源化VISTA KI小鼠的MC38肿瘤模型中，VISTA.18与抗PD-1联用产生的抗肿瘤效果与VISTA.16相当，证明了酸性pH选择性抗体能够有效地在肿瘤局部发挥作用，同时避免了全身性的靶点介导的药物处置（TMDD），具有更优的治疗窗口。

四、 主要研究结果

1. VISTA是酸性pH选择性的免疫检查点配体：实验数据一致表明，VISTA仅在模拟肿瘤微环境的酸性pH下才能有效结合免疫细胞并发挥强大的免疫抑制功能，而在中性pH下其活性显著减弱。这解释了为何VISTA主要在肿瘤局部起作用。
2. PSGL-1是VISTA在酸性pH下的功能受体：通过质谱捕获、基因敲除/过表达、以及多种生物物理方法，确凿证明了PSGL-1是介导VISTA酸性pH依赖性抑制功能的关键受体。
3. 组氨酸质子化与酪氨酸硫酸化驱动特异性结合：VISTA细胞外结构域表面密集的组氨酸残基，在酸性环境中质子化带正电荷，与PSGL-1 N端硫酸化酪氨酸所带的负电荷形成关键的离子相互作用，这是实现pH选择性和结合特异性的结构基础。
4. 酸性pH选择性抗体具有治疗优势：研究成功开发了能够区分VISTA“活性”（酸性pH）和“非活性”（中性pH）状态的阻断抗体。体内实验证明，这种pH选择性抗体（VISTA.18）能在肿瘤部位有效富集并发挥抗肿瘤作用，同时避免了在全身血液循环中因靶点结合而被快速清除的问题，展现了更理想的药物代谢动力学特性和潜在的安全性优势。
5. 靶向VISTA/PSGL-1通路可增强抗PD-1疗效：在临床前模型中，阻断VISTA与PD-1的联合疗法展现出显著的协同抗肿瘤效果，提示该通路是克服免疫检查点抑制剂耐药性的一个有前景的新靶点。

各结果之间逻辑严密：从现象（pH选择性）出发，到机制探索（受体鉴定、结构解析），再到功能验证（体外、体内）和应用转化（抗体工程与评估），构成了一个完整的研究闭环。

五、 研究结论与意义

本研究得出结论：VISTA是一种新型的、由肿瘤微环境酸性pH激活的免疫检查点分子，其通过结合PSGL-1来抑制T细胞功能。这一发现揭示了肿瘤免疫逃逸的一个此前未被充分认识的机制——利用局部微环境的物理化学特性（pH）来精准调控免疫反应。

其科学价值在于： * 机制创新：提出了“pH门控”的免疫检查点新范式，扩展了我们对免疫共刺激/共抑制信号调控复杂性的认识。不同于传统的转录或翻译后水平调控，这种基于微环境pH的变构调节提供了一种快速、可逆的调控方式。 * 靶点明确：明确了PSGL-1是VISTA在肿瘤微环境中的关键功能性受体，解决了该领域长期存在的一个核心问题，为精准药物设计奠定了基础。 * 转化启示：证明了针对肿瘤微环境特性（如酸性pH）设计选择性药物的可行性和优势。本研究开发的pH选择性抗体策略，为开发下一代具有更高肿瘤靶向性和更低全身毒性的免疫疗法提供了创新思路和技术路线。

六、 研究亮点

1. 重要的原创性发现：首次系统阐明并证明了VISTA的酸性pH选择性及其分子机制，发现了PSGL-1作为其酸性pH下关键受体的新功能。
2. 多学科交叉的研究方法：整合了从原子分辨率的晶体结构解析，到细胞水平的受体鉴定与功能验证，再到动物模型的治疗评估，研究层次清晰，证据链完整。
3. “从机制到药物”的转化型研究典范：不仅回答了基础科学问题，还基于机制洞察，主动设计和评估了具有潜在临床应用价值的新型治疗性抗体（pH选择性抗体），展现了强大的转化医学潜力。
4. 对肿瘤免疫治疗领域的贡献：为克服现有免疫检查点抑制剂耐药性提供了新的联合治疗靶点（VISTA/PSGL-1轴），并提出了利用肿瘤微环境特性优化药物设计的创新策略。

七、 其他有价值的内容

研究还探讨了VISTA与其他潜在配体（如VSIG-3、GP1bα）的关系，并通过实验表明在这些体系中未能重复出强特异性的相互作用，或与PSGL-1不存在竞争，进一步突出了PSGL-1在所述机制中的主要地位。此外，研究提供了关于VISTA在人和小鼠之间序列保守性的详细数据，支持了研究发现的普适性。