本研究由上海交通大学微生物代谢国家重点实验室的韩伟尚（Weishang Han）、肖录驰（Luchi Xiao）、孙皓程（Haocheng Sun）等作为共同第一作者，通讯作者为鲁洪中（Hongzhong Lu），联合丹麦生物创新研究所、查尔姆斯理工大学等多家国际研究机构，在 Nature Communications 期刊（2026年17卷8720号）上发表。研究开发了名为AlphaGem的计算工具箱，用于为非模式生物自动构建高质量的基因组规模代谢模型（Genome-scale Metabolic Models, GEMs）。
基因组规模代谢模型是表征细胞代谢的强大计算框架，能够预测生物体在各种遗传和环境扰动下的生理响应，广泛应用于代谢工程中的菌株优化、药物发现中的治疗靶点识别、微生物群落代谢互作研究以及个性化医疗等领域。然而，现有高质量GEMs（如Yeast-GEM、iML1515、Human-GEM）的构建依赖多年的人工策展（manual curation），这一过程劳动密集且耗时，无法满足高通量测序产生的大量新测序物种的建模需求。现有自动化工具（如CarveMe、ModelSEED、GapSeq等）虽然在速度上有所提升，但生成的模型质量欠佳，常需人工修正方可使用。特别地，基于模板的工具往往缺乏物种特异性，而基于基因组的工具则受限于蛋白质注释精度不足。此外，传统基于序列相似性的同源关系推断方法难以识别序列差异较大但功能相似的远源同源蛋白，导致模型遗漏关键代谢功能。针对上述瓶颈，AlphaGem集成了蛋白质三维结构比对和基于深度学习的蛋白质功能预测，以期实现跨物种的高质量、高通量GEM自动重建。
AlphaGem的整体框架包含四个主要模块。
第一模块：同源关系推断。 AlphaGem以模式生物的高质量策展GEM为参考模板——原核生物采用大肠杆菌模型iML1515，单细胞真核生物和真菌采用酿酒酵母模型Yeast9，哺乳动物细胞采用人类模型Human1。同源关系推断采用两种互补策略：当目标物种具有蛋白质组规模的三维结构预测数据时，综合运用OrthoFinder进行基于序列的直系同源聚类、US-align进行结构比对过滤（TM-score阈值默认0.5，覆盖度≥0.8，pLDDT≥0.7）以及FoldSeek进行结构比对扩展（TM-score≥0.7，覆盖度≥0.8，probability=1），形成最终的同源蛋白对集合。当计算资源受限或缺乏结构数据时，采用基于蛋白质语言模型的PLMSearch方法推断同源关系，并通过BLASTp的序列覆盖度（>0.6）和序列一致性（>30%）进行后过滤，辅以Diamond全局比对的双向最佳命中（BBH）补充遗漏的同源对。此外，AlphaGem还设计了基于ProtTrans蛋白质语言模型的同源关系精修步骤，通过主成分分析对具有异常多同源蛋白的蛋白质进行距离筛选，以消除假阳性。
第二模块：非直系同源蛋白的暗代谢挖掘。 对于未能通过同源关系映射的蛋白质，AlphaGem采用集成管线进行功能注释，综合了CLEAN（EC编号预测）、DeepECTranformer（EC编号预测）、EggNOG-Mapper（KEGG Orthology注释）和PLMSearch（Rhea反应预测）四种工具的预测结果。各工具的输出统一映射至Rhea反应编号，并按照工具的特异性和灵敏度分配权重分数（EggNOG-Mapper: 0.3, CLEAN: 0.2, DeepECTranformer: 0.2, PLMSearch: 0.1），累计权重分数≥0.4的蛋白质-反应对被视为可靠注释并整合入模型。
第三模块：草稿模型重建与反应库扩展。 基于同源关系从参考模型中保留相应反应，根据基因-蛋白质-反应（Gene-Protein-Reaction, GPR）关系重新注释目标物种的基因。对于同工酶催化的反应，若至少存在一个对应的同工酶即认为该反应存在；对于蛋白质复合体催化的反应，要求超过80%的复合体蛋白质被识别。从Rhea数据库提取标准化反应信息生成可直接用于COBRApy的反应对象池，将新注释的反应纳入模型，并确保质量与电荷平衡。亚细胞定位方面，从参考模型继承区室注释，新整合的反应默认定位于胞质。
第四模块：缺口填补。 使用COBRApy的gap-filling功能，以参考模型或参考模型与通用模型的合并模型为模板，在基本或完全培养基条件下迭代填补代谢网络缺口。填补过程中通过tBLASTn搜索目标物种基因组，以比对命中（bit score>200）的蛋白质替换原同源蛋白；若无合格命中则尝试移除该反应，同时保证生物量目标反应的完整性。
验证数据集与样本规模： 研究在多个物种上验证了AlphaGem的性能，包括原核生物（肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis）、单细胞真核生物（白色念珠菌Candida albicans、粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe、红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides、毕赤酵母Pichia pastoris）、哺乳动物（小鼠Mus musculus、中国仓鼠Cricetulus griseus），以及大规模332种酵母物种。模型质量通过碳源利用预测、必需基因预测、MEMOTE质量评估及与人工策展模型和现有自动化工具（CarveMe、ModelSEED、GapSeq、CarveFungi）的基准对比进行系统评价。
同源关系推断性能显著提升。 在白色念珠菌与酿酒酵母的比较中，结合序列与结构比对的三步流程相较于纯序列聚类方法多识别了9.01%的同源蛋白对，同时准确性从94.91%提升至95.36%。研究发现，部分蛋白质对虽序列一致性较低（如细胞色素b的31.37%一致性）但TM-score高达0.78，具有相同的催化功能；反之，部分高序列一致性（45.71%）但低结构相似性（TM-score=0.21）的蛋白质对功能存在差异。这表明结构比对能有效识别远源同源并过滤假阳性。PLMSearch方法在白色念珠菌上的准确性达到93.92%，与整合序列和结构的方法（95.36%）接近，同时额外识别了14.61%的同源对，证明其在结构数据不可用时的实用价值。
集成注释管线优于任何单一工具。 在白色念珠菌和粟酒裂殖酵母的非同源蛋白功能注释评估中，AlphaGem集成管线的F1分数（0.379和0.709）均高于CLEAN（0.326和0.654）、DeepECTranformer（0.189和0.423）、PLMSearch（0.097和0.105）和EggNOG-Mapper（0.094和0.137）。逐工具递增分析表明，注释F1分数随集成工具数量增加而提升，证实了集成策略的有效性。此外，该管线成功识别了红冬孢酵母蛋白M7XU53为水杨酸1-单加氧酶（EC 1.14.13.1），该酶催化水杨酸的氧化脱羧反应，消耗NADH和O₂生成儿茶酚、CO₂和H₂O，其高结构相似性（US-align TM-score=0.84）支持了这一“暗代谢”发现。
模型质量全面达到或超越现有工具水平。 对于白色念珠菌，AlphaGem构建的模型在碳源利用预测上达到78.26%的准确率，接近人工策展模型的97.44%，远超CarveFungi的27.27%；在必需基因预测上达到79.90%，甚至高于人工策展模型的73.04%。对于粟酒裂殖酵母，AlphaGem模型碳源利用准确率为90.00%（人工策展为95.24%），必需基因准确率为71.93%（人工策展为69.89%）。值得注意的是，AlphaGem通过结构比对识别了d-葡萄糖胺6-磷酸转移酶和木糖醇转运蛋白等序列聚类未能发现的同源蛋白，使模型能够正确预测白色念珠菌利用木糖醇和d-葡萄糖胺的表型，且未引入额外的假阳性预测。
细菌与哺乳动物建模性能验证。 对于肺炎克雷伯菌，AlphaGem模型的碳源利用预测准确率为75.32%，接近人工策展模型iYL1228的81.8%，显著优于CarveMe（45.45%）、ModelSEED（41.56%）和GapSeq（16.67%的特异性）。AlphaGem模型注释了1588个基因，多于GapSeq的1260个和iYL1228的1228个，同时缺口填补仅需添加2个反应，而GapSeq需添加63个，表明其基因注释更为准确完整。对于枯草芽孢杆菌，AlphaGem在必需基因预测上达到85.52%的准确率，优于GapSeq（79.35%）、CarveMe（83.09%）和ModelSEED（77.24%），略低于人工策展模型的89.26%。对于小鼠，AlphaGem模型的必需基因预测准确率为91.10%，高于Mouse1模型的88.62%，且多注释了488个基因，其中64.5%被深度学习工具确认为可靠的代谢蛋白，而Mouse1的独有基因中仅9.4%编码可靠代谢蛋白。
大规模332种酵母物种建模。 AlphaGem通过PLMSearch方法自动重建了332种酵母的GEM。t-SNE聚类分析显示，AlphaGem模型展现出与人工策展模型相当的系统发育聚类模式，且轮廓系数更高（0.138 vs. 0.103），表明AlphaGem模型能更好地反映物种分类关系。AlphaGem识别了1944个核心反应和3628个辅助反应，与人工策展模型的2083个核心反应和2376个辅助反应相比，展现了更广泛的物种特异性代谢分化。在底物利用验证中，AlphaGem模型的准确性与人工策展模型相当（Cohen’s dz = −0.23），且特异性显著更高（p值<0.001）。暗代谢分析发现，AlphaGem新增的反应主要富集于次生代谢、微生物在不同环境中的代谢以及辅因子生物合成等通路。
AlphaGem成功构建了一个整合蛋白质结构比对和深度学习蛋白质功能推断的自动化GEM重建工具箱，能够在跨物种范围内（从简单的细菌到复杂的哺乳动物）生成与人工策展模型质量相当的高质量代谢模型，同时显著优于现有自动化工具。其科学价值在于证明了蛋白质结构比序列在进化上更为保守这一原理在代谢建模中的实用性——通过结构比对能够识别序列方法遗漏的远源同源关系，从而更精确地刻画非模式生物的代谢能力。其应用价值体现在：一是为大量新测序物种提供了高效、可扩展的建模方案，缩小了基因组数据积累与代谢模型可用性之间的鸿沟；二是通过暗代谢挖掘揭示非模式生物中未被数据库记录的物种特异性代谢通路；三是为微生物群落生态、代谢工程和药物靶点发现等领域提供可靠的模型基础。
本研究的核心创新在于：（1）首次在GEM自动重建中系统整合蛋白质组规模的三维结构比对，利用结构保守性优于序列保守性的进化原理提高同源关系推断的准确性；（2）开发了基于多个深度学习工具的集成注释管线用于暗代谢挖掘，有效扩展了物种特异性反应网络；（3）采用结构优先的冲突解决策略，在高序列一致性但低结构相似性的情况下优先信任结构证据，避免了假同源蛋白的引入；（4）通过332种酵母物种的大规模重建展示了工具箱的高通量能力和跨物种通用性。此外，研究还揭示了模型质量的系统性瓶颈——哺乳动物模型的预测灵敏度受限反映了真核生物建模中功能冗余和通用模型与组织特异性生物学背景之间的固有不匹配，为未来整合多组学数据和酶约束以提升预测能力指明了方向。